核酸提取保存液的制作方法
【专利摘要】一种核酸提取保存液，包括：缓冲液，非离子型表面活性剂，生物表面活性剂，及牛血清白蛋白。根据本发明的保存液可以将细胞等样本放入核酸提取保存液后，并使DNA稳定保存于核酸提取保存液中，节省实验室提取核酸时间。
【专利说明】核酸提取保存液
[0001] _
【技术领域】
[0002]本发明涉及核酸提取保存液，尤其涉及在送样过程中可使得样本进行裂解，并使样本的DNA稳定保存于其中的核酸提取保存液。
[0003]
【背景技术】
[0004]能够从细胞裂解物和其他来源提取核酸的微流技术的发展促进了对生物样品的核酸进行快速分析。快速提取方法可以与聚合酶链式反应(PCR)之类的扩增技术组合以从血液、组织、培养的细胞或其他生物材料的微量样品中提取有用量的核酸
准确的检测DNA是分子生物学样品分析的一个重要方面。不同样本，如血液，口腔拭子都包含DNA，可用于PCR为基础的各种分析方法。从现有技术来看，快速提取DNA并去除抑制剂和纯化DNA，然后再执行下游酶的扩增是非常重要的，例如PCR扩增。
[0005]尽管许多种DNA的分离和纯化方法和试剂盒可通过供应商购买，但现有检测试剂盒一般是将样本存放于核酸保存液，待回到实验室后，使用其它提取方法进行提取，整个过程超过一个小时，如果样本多的情况下，提取时间还会大大延长。提取速度决定了标本的一半以上的检测时间，因此现有核酸提取保存液增加了 DNA分离和纯化的时间和费用。
[0006]
【发明内容】
[0007]为了克服现有技术的不足，本发明旨在提供一种本试剂盒可以对采样的不同样本，如:血液、口腔脱落细胞、上皮组织细胞等进行保存，在送样过程中进行裂解，并使DNA稳定保存于核酸提取保存液中，由于体系中各种混合成分的存在，配合实验室需要的引物序列，可直接用于PCR体系的扩增。
[0008]为了达到上述发明目的，本发明提供了一种核酸提取保存液，包括:缓冲液，非离子型表面活性剂，生物表面活性剂，及牛血清白蛋白。
[0009]一些实施例中，所述缓冲液包括Tris-HCl,氯化钾,或氯化镁,或者它们的组合。
[0010]一些实施例中，Tris-HCl的含量为20400毫摩尔/升，氯化钾的含量为2050毫摩尔/升，氯化镁的含量为13晕摩尔/升。
[0011 ] 一些实施例中，所述非离子型表面活性剂为聚山梨酯或聚乙二醇辛基苯基醚，或者它们的组合。
[0012]一些实施例中，所述聚山梨酯的含量为0.01%_1%质量百分比，聚乙二醇辛基苯基醚的含量为0.01%_1%质量百分比。
[0013]一些实施例中，所述生物表面活性剂为表面活性肽。
[0014]一些实施例中，所述表面活性肽的含量为0.01%_1%质量百分比。
[0015]—些实施例中，所述牛血清白蛋白的含量为1-3晕克/晕升。
[0016]一些实施例中，所述核酸提取保存液还可包括0.01-1%质量百分比的十二烷基硫酸钠。
[0017]一些实施例中，所述核酸提取保存液还可包括0.1-2 U /毫升的DNA聚合酶。
[0018]本发明的优点在于，根据本发明的保存液可以将细胞等样本放入核酸提取保存液后，并使DNA稳定保存于核酸提取保存液中，节省实验室提取核酸时间。
[0019]
【具体实施方式】
[0020]下文将更详细地描述本发明。然而，本发明可以以许多不同形式实现，并且不应解释为受在此提出之实施例的限制。相反，提出这些实施例是为了达成充分及完整公开，并且使本【技术领域】的技术人员完全了解本发明的范围。
[0021]应理解，本发明的描述为单个单元的部分可存在于两个或两个以上的物理上独立但合作实现所描述之功能的实体。此外，描述为两个或两个以上物理上独立的部分可集成入一个单独的物理上实体以进行所描述的功能。
[0022]现通过详细说明根据本发明的核酸提取保存液的较佳具体实施例，以对本发明做进一步阐述。
[0023]本实施例中，可对血清、血浆、细胞进行保存和裂解。细胞可例如包括口腔脱落细胞、上皮组织细胞等。然而，本发明不限于此，而是可对任何合适的需要进行DNA裂解和提取的样本进行保存。
[0024]根据本发明的实施例的核酸提取保存液，包括:缓冲液，非离子型表面活性剂，生物表面活性剂，及牛血清白蛋白。根据本发明的实施例，所述核酸提取保存液可对样本进行保存和DNA裂解。本实施例中，所述样本可为以阴道分泌物为代表的含有较多杂质和干扰物质的样本。
[0025]缓冲液含10mM Tris-HCl，pH为8.3-9.0 (室温)，而在延伸温度(72 °C)下，pH值接近7.2。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活DNA聚合酶的活性中心，一般使用Mg2+，有时使用Mn2+。一般以MgC12的形式提供，标准浓度为1.5mM。Mg2+浓度的高低会影响扩增的特异性和产率。缓冲液中还含有50mM的钾离子。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含G+C模板的扩增效率。
[0026]本实施例中，所述缓冲液包括Tris-HCl,氯化钾，或氯化镁,或者它们的组合。较佳实施例中，Tris-HCl的含量为20400毫摩尔/升，氯化钾的含量为2050毫摩尔/升，氯化镁的含量为13晕摩尔/升。
[0027]提供水中的一个离子缓冲浓度，此为常用的缓冲体系。Tris是一种双极性离子缓冲液，20°C 时其 pKa 值为 8.3，ApKa 值为-0.021/°C。因此，20mmol/l Tris-HCl (ρΗ8.3，20°C)。在实际PCR中，pH变化于6.8-7.8之间。改变反应液的缓冲能力，如将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9，有时会增加产量。
[0028]反应混合液中50mmol/L以内的KCl，pH8.9有利于引物的退火，镁离子为DNA聚合酶酶催化过程中，结合到酶一底物结合体上，从而使催化反应的活化能更加降低。使得反应能够进行。
[0029]本实施例中，所述非离子型表面活性剂为聚山梨酯或聚乙二醇辛基苯基醚，或者它们的组合。较佳实施例中，所述聚山梨酯的含量为0.01%-1%质量百分比，聚乙二醇辛基苯基醚的含量为0.01%-1%质量百分比。
[0030]本实施例中，所述聚山梨酯可选用吐温20，以起到保护DNA聚合酶作用。所述聚乙二醇辛基苯基醚可选用Triton X-100，分子量为646.86 (C34H62011)，其能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。
[0031]本实施例中,所述生物表面活性剂为表面活性肽。较佳实施例中,所述表面活性肽的含量为0.01%-1%质量百分比。
[0032]牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blockingage ;在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。本实施例中，所述牛血清白蛋白的含量为1-3毫克/毫升。
[0033]此外，根据本实施例的核酸提取保存液，还可包括0.1-1%质量百分比的十二烷基硫酸钠，0.01-1%质量百分比的蛋白酶K，及/或0.1-1%质量百分比的叠氮化钠。
[0034]较佳实施例中，根据本实施例的核酸提取保存液还包括脱氧核苷三磷酸(dNTP)。脱氧核苷三磷酸是DNA合成的底物，标准的PCR反应体系中含有等摩尔浓度的4种dNTP，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP，浓度一般为 350-600 毫摩尔 / 升。
[0035]较佳实施例中，为了进一步加快后续的DNA分解，所述核酸提取保存液还可包括0.1-2 U /毫升的DNA聚合酶。本实施例中，所述DNA聚合酶可为Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶，Pwo DNA聚合酶，或Pfu DNA聚合酶。
[0036]现详细描述根据本发明实施例的核酸提取保存液的实例。
[0037]需要30万级及以下洁净区，使用分子级别洁净水，除水及缓冲液之外的所有成分采购自成家SIGMA，使用大型烧杯和磁力搅拌器。
[0038]实例一
首先加入适量的洁净水，然后依次搅拌加入Tris-盐酸(20 mmol/1 Tris-HCl，ρΗ8.3，20°C)，氯化钾溶液(20 mmol/1 )，和氯化镁溶液(I mmol/1)作为缓冲剂。此后，再加入吐温20 (0.01%质量百分比)和Triton X-100 (0.01%质量百分比)作为非离子型表面活性剂。接着，加入表面活性肽(0.01%质量百分比)，以及的牛血清蛋白(BSA，I毫克/毫升)。由此形成根据本发明实施例的核酸提取保存液。
[0039]实例二
首先加入适量的洁净水，然后依次搅拌加入Tris-盐酸(400 mmol/1 Tris-HCl，ρΗ8.3，20°C)，氯化钾溶液(50 mmol/1 )，和氯化镁溶液(3 mmol/1)作为缓冲剂。此后，再加入吐温20 (1%质量百分比)和Triton X-100 (1%质量百分比)作为非离子型表面活性剂。接着，加入表面活性肽(1%质量百分比)，以及的牛血清蛋白(BSA，3毫克/毫升)。由此形成根据本发明实施例的核酸提取保存液。
[0040]实例三
首先加入适量的洁净水，然后依次搅拌加入Tris-盐酸(200 mmol/1 Tris-HCl，ρΗ8.3，20°C)，氯化钾溶液(25 mmol/1 )，和氯化镁溶液(1.5 mmol/1)作为缓冲剂。此后，再加入吐温20 (0.5%质量百分比)和Triton X-100 (0.5%质量百分比)作为非离子型表面活性剂。接着，加入表面活性肽(0.5%质量百分比)，以及的牛血清蛋白(BSA，1.5毫克/毫升)。由此形成根据本发明实施例的核酸提取保存液。
[0041]实例四
首先加入适量的洁净水，然后依次搅拌加入Tris-盐酸(200 mmol/1 Tris-HCl,pH8.3,20°C)，氯化钾溶液(25 mmol/1 )，和氯化镁溶液(1.5 mmol/1)作为缓冲剂。此后，再加入吐温20 (0.5%质量百分比)和Triton X-100 (0.5%质量百分比)作为非离子型表面活性剂。接着，加入表面活性肽(0.5%质量百分比)，以及的牛血清蛋白(BSA，1.5毫克/毫升)。此后，再加入浓度350 umol/Ι的dNTPs。由此形成根据本发明实施例的核酸提取保存液。
[0042]实例五
首先加入适量的洁净水，然后依次搅拌加入Tris-盐酸(200 mmol/1 Tris-HCl,pH8.3,20°C)，氯化钾溶液(25 mmol/1 )，和氯化镁溶液(1.5 mmol/1)作为缓冲剂。此后，再加入吐温20 (0.5%质量百分比)和Triton X-100 (0.5%质量百分比)作为非离子型表面活性剂。接着，加入表面活性肽(0.5%质量百分比)，以及的牛血清蛋白(BSA，1.5毫克/毫升)。此后，再加入浓度为0.01%质量百分比的十二烷基硫酸钠(SDS)或蛋白酶K。由此形成根据本发明实施例的核酸提取保存液。
[0043]实例六
首先加入适量的洁净水，然后依次搅拌加入Tris-盐酸(200 mmol/1 Tris-HCl,pH8.3,20°C)，氯化钾溶液(25 mmol/1 )，和氯化镁溶液(1.5 mmol/1)作为缓冲剂。此后，再加入吐温20 (0.5%质量百分比)和Triton X-100 (0.5%质量百分比)作为非离子型表面活性剂。接着，加入表面活性肽(0.5%质量百分比)，以及的牛血清蛋白(BSA，1.5毫克/毫升)。此后，再加入浓度为0.1%质量百分比的热启动Taq DNA聚合酶。由此形成根据本发明实施例的核酸提取保存液。
[0044]实例七
首先加入适量的洁净水，然后依次搅拌加入Tris-盐酸(200 mmol/1 Tris-HCl,pH8.3,20°C)，氯化钾溶液(25 mmol/1 )，和氯化镁溶液(1.5 mmol/1)作为缓冲剂。此后，再加入吐温20 (0.5%质量百分比)和Triton X-100 (0.5%质量百分比)作为非离子型表面活性剂。接着，加入表面活性肽(0.5%质量百分比)，以及的牛血清蛋白(BSA，1.5毫克/毫升)。此后，再加入适量甘油和0.1%质量百分比的叠氮化钠。由此形成根据本发明实施例的核酸提取保存液。
[0045]实例八
首先加入适量的洁净水，然后依次搅拌加入Tris-盐酸(200 mmol/1 Tris-HCl,pH8.3,20°C)，氯化钾溶液(25 mmol/1 )，和氯化镁溶液(1.5 mmol/1)作为缓冲剂。此后，再加入吐温20 (0.5%质量百分比)和Triton X-100 (0.5%质量百分比)作为非离子型表面活性剂。接着，加入表面活性肽(0.5%质量百分比)，以及的牛血清蛋白(BSA，1.5毫克/毫升)。此后，再加入浓度500 umol/Ι的dNTPs。接着，再加入浓度为0.5%质量百分比的SDS或蛋白酶K。此后，再加入浓度为1%质量百分比的热启动Taq DNA聚合酶。最后，再加入适量甘油和0.5%质量百分比的叠氮化钠。由此形成根据本发明实施例的核酸提取保存液。
[0046]本发明的优点在于，现有检测试剂盒一般是将样本存放于核酸保存液，待回到实验室后，使用其它提取方法进行提取，整个过程超过一个小时，如果样本多的情况下，提取时间还会大大延长，因此，提取速度决定了标本的一半以上的检测时间。本技术可以将细胞等样本放入核酸提取保存液后，并使DNA稳定保存于核酸提取保存液中，节省实验室提取核酸时间。
[0047]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。此夕卜，显然“包括” 一词不排除其他单元或步骤，单数不排除复数。系统权利要求中陈述的多个单元或装置也可以由一个单元或装置通过软件或者硬件来实现。第一，第二等词语用来表示名称，而并不表示任何特定的顺序。
【权利要求】
1.一种核酸提取保存液，其特征在于，包括:缓冲液，非离子型表面活性剂，生物表面活性剂，及牛血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述的核酸提取保存液，其特征在于，所述缓冲液包括Tris-HCl，氯化钾，或氯化镁，或者它们的组合。
3.根据权利要求2所述的核酸提取保存液，其特征在于，Tris-HCl的含量为20— 400毫摩尔/升，氯化钾的含量为20 — 50毫摩尔/升，氯化镁的含量为I 一 3毫摩尔/升。
4.根据权利要求1所述的核酸提取保存液，其特征在于，所述非离子型表面活性剂为聚山梨酯或聚乙二醇辛基苯基醚，或者它们的组合。
5.根据权利要求4所述的核酸提取保存液，其特征在于，所述聚山梨酯的含量为0.01%-1%质量百分比，聚乙二醇辛基苯基醚的含量为0.01%-1%质量百分比。
6.根据权利要求1所述的核酸提取保存液，其特征在于，所述生物表面活性剂为表面活性肽。
7.根据权利要求6所述的核酸提取保存液，其特征在于，所述表面活性肽的含量为0.01%-1%质量百分比。
8.根据权利要求1所述的核酸提取保存液，其特征在于，所述牛血清白蛋白的含量为1_3晕克/晕升。
9.根据权利要求1所述的核酸提取保存液，其特征在于，所述核酸提取保存液还可包括0.01-1%质量百分比的十二烷基硫酸钠。
10.根据权利要求1所述的核酸提取保存液，其特征在于，所述核酸提取保存液还可包括0.1-2 U /毫升的DNA聚合酶。
【文档编号】C12N15/10GK104450674SQ201310438106
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】陈坚, 黎飒 申请人:上海艾迪康医学检验所有限公司