一种分离纯化神经氨酸酶（禽流感病毒）的方法
【专利摘要】一种分离纯化神经氨酸酶（禽流感病毒）的方法，将神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)特异的竞争性抑制剂4-氨基苯草氨酸作为亲和配体，固定于环氧化磁性微粒（Magneticparticle,MP）表面，制备成对NA具有特异亲和力的功能化磁性微粒并用此微粒与含有NA的流感病毒株以pH为5.5的缓冲体系结合、清洗；以pH为9.1的缓冲体系洗脱分离纯化NA。本发明既避免了基因工程方法获取的NA无法满足NA糖基化研究的缺陷，又解决了商品化草酸琼脂糖亲和柱分离NA操作程序复杂，价格昂贵，洗脱体积大，难以微量化等技术问题。该方法操作简便快捷、特异性高，对NA有着良好的提纯效果。
【专利说明】一种分离纯化神经氨酸酶(禽流感病毒)的方法
[0001]【技术领域】
本发明涉及一种分离纯化神经氨酸酶(禽流感病毒)的方法，具体涉及一种基于磁性微粒分离纯化神经氨酸酶(禽流感病毒)的方法。
【背景技术】 [0002]磁性微粒(Magnetic particle, MP)简称磁粒,作为一种具有超顺磁性且很容易被各种功能基团修饰的载体，被广泛应用到生物化学，细胞生物学，微生物学，以及临床医学等众多领域。磁性微粒被广泛应用的原因是其具有以下特征:磁响应性好，矫顽力基本为零，即具备超顺磁性；粒径可以达到纳米级；具有很好的化学稳定性；生产工艺相对简单，且价格合理。所以在蛋白质分离中，经常通过固定化有生物活性的酶，或者能与抗原特异性结合的抗体以及对糖链具有特异识别能力的凝集素，制备成可用于分离特异性蛋白，抗原和糖蛋白/糖脂类物质。这些应用均基于溶液中的磁性微粒在磁场作用下可以迅速分离，而在撤除磁场时可以很好的悬浮于溶液中，并且仍保持性质稳定，有利于纯化蛋白的洗脱，而且该过程操作简单，易于广泛应用。
[0003]4-氨基苯草氨酸,又称对氨基苯厢酸,是神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)特异的竞争性抑制剂，可与NA特异性的结合，本实验中以它作为亲和配体，修饰于环氧化磁性微粒表面，使该4-氨基苯草氨酸功能化磁性微粒对神经氨酸酶具有特异的亲和力。而本实验自制的环氧化磁粒，是由Fe4O3磁性微粒经3-缩水甘油丙醚基三甲氧基硅烷(GPTS)修饰而来，在结构上具有合适的延伸臂长(即亲和配体与支持体磁性微粒之间的长度)，其末端的环氧化基团具有活泼的化学反应活性，满足实验中连接亲和配体4-氨基苯草氨酸的要求。
[0004]与其他病毒组分相比，在NA的分离过程中最难实现的是NA与HA的分离。两者均位于病毒嚢膜表面，且同为糖蛋白，而NA四聚体又与HA三聚体分子量相近，因此一般的分离手段很难将其进行分离。传统上曾使用盐析法、密度梯度超速离心等，不但操作繁复且提取效果差强人意，从病毒中获取神经氨酸酶并无十分行之有效的手段。近几年，国内外获取流感病毒神经氨酸酶一般基于两种思路。一种思路是使用基因工程的手段，使用已知禽流感病毒NA基因进行序列设计、引物合成、基因克隆并构建表达载体，并在梭菌、昆虫细胞等细胞株中进行表达，从而获取表达的NA蛋白。此种方法虽然可以获取较纯的NA蛋白，但是此种蛋白或者不存在糖基化等翻译后修饰，或者即使存在，可想而知的是其翻译后修饰的状态也将与病毒中天然存在的状态多为不同，不能应用于神经氨酸酶的糖基化等方面的研究。还有一是方法主要是基于一种商品化的草氨酸琼脂糖亲和柱，N-(p-aminophenyl)oxamic acid agarose (美国sigma公司),使用此方法从病毒中提取NA,效果优于传统方法，也可应用于NA的糖基化等方面的研究，但存在价格昂贵，琼脂糖非特异性的吸附较大，洗脱体积大难以微量化等技术问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种分离纯化神经氨酸酶(禽流感病毒)的方法，该方法将NA特异的竞争性抑制剂4-氨基苯草氨酸作为亲和配体，固定于环氧化磁性微粒表面，制备成对NA具有特异亲和力的功能化磁性微粒，并用此微粒在pH为5.5的缓冲体系下与神经氨酸酶进行结合、清洗，使用pH为9.1的缓冲体系进行洗脱得到分离纯化的神经氨酸酶。
[0006]本发明的技术方案是:
一种分离纯化神经氨酸酶(禽流感病毒)的方法，其特殊之处是:该方法将神经氨酸酶特异的竞争性抑制剂4-氨基苯草氨酸作为亲和配体，固定于环氧化磁性微粒表面，制备成对神经氨酸酶具有特异亲和力的功能化磁性微粒，并用此微粒与含有神经氨酸酶的流感病毒株以pH为5.5的缓冲体系结合、清洗；以pH为9.1的缓冲体系洗脱分离纯化神经氨酸酶。
[0007]上述制备成对神经氨酸酶有特异亲和力的功能化磁性微粒包括:提取含200 mg环氧化磁性微粒的悬液，将该环氧化磁性微粒修饰为4-氨基苯草氨酸功能化磁性微粒；
所述修饰包括:
第一步修饰:将上述悬液置于反 应器内，用无水乙醇清洗；再将反应器置于磁性分离器上进行磁性分离，弃去上层中不含磁性微粒的清液；
称取0.1081g对苯二胺溶于50mL无水乙醇,充分溶解后转入反应器内；使环氧磁粒和对苯二胺充分混合、反应，将环氧化磁粒修饰成对苯二胺修饰磁粒；反应完成后，磁性分离，并弃去上清液；
第二步修饰:将上述反应完成后得到的对苯二胺修饰磁粒用无水乙醇清洗，再用超纯水清洗，换至新的反应器中，磁性分离后，弃去上层中不含磁性微粒的清液；
向烧瓶中加入50 mL pH 5.0~6.0的0.1~0.2M MES缓冲液，再加入0.1260g 二水草酸，搅拌使草酸充分溶解并与磁粒混合均匀，加入EDC 0.1970 g，NHS 0.1151 g，于4°C反应8小时以上，将对苯二胺修饰磁粒制成4-氨基苯草氨酸功能化磁粒；
反应完成后，磁性分离，弃去上清液；用超纯水清洗磁粒，定容至20 mL，转入试剂瓶，差量法称量计算此4-氨基苯草氨酸功能化磁粒悬液的固体物含量，贴签，4°C保存备用。
[0008]此修饰过程中，所述反应物、反应体系的用量及配比为最佳状态，实际操作中可根据情况适当调整，在以下所述的范围内也可达到修饰目的:
以最初起始物料对苯二胺的质量数作为参照，每克对苯二胺可对应无水乙醇30-100mL, MES 缓冲液 30-100 mL，EDC 0.12-2.7 g,NHS 0.06-1.5 g，且满足EDC:NHS 比例保持在1:1-1:5 之间。
[0009]对苯二胺:二水草酸=1:1.166此比例最好保持不变，其中二水草酸可用草酸代替，代替后比例为对苯二胺:草酸=1:0.833
按不同配比加入EDC、NHS后注意反应体系pH值，若超出pH 5_6，应调至此范围。
[0010]上述神经氨酸酶的流感病毒株来自接种的10日龄鸡胚尿囊液；该病毒株的颗粒悬浮于尿囊液中。
[0011]上述含有神经氨酸酶的流感病毒株使用前需要对该病毒株的颗粒进行裂解与蛋白粗提；所述裂解与蛋白粗提采用乙醚提取法。
[0012]上述分离纯化神经氨酸酶(禽流感病毒)的方法，其特殊之处是，该方法具体是，
(I)磁粒的封闭:取一支2mL离心管，中向其中加入3 mg4-氨基苯草氨酸磁粒，磁性
分离，弃上清；然后向离心管中加入封闭缓冲液500 ，混合均匀，后置于气浴振荡器中，37 °C 180 rpm 反应 30 min ；
(2)磁粒的平衡与活化:上步反应完成后，将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，弃去上清液，每次加入I mL平衡缓冲液，清洗:再加入I mL结合缓冲液清洗磁粒；
(3)样本与磁粒的结合:取一支新的离心管，加入乙醚处理过的病毒粗提蛋白5mg，按比例加入2X结合缓冲液与超纯水,使得体系结合缓冲液浓度为IX，体积为ImL;标记为
“原样”待用；取此溶液950 加入装有上步已活化磁粒的离心管中，轻轻摇晃至混合均
匀，置于气浴振荡器中37°C 180 rpm反应2h;反应完成后磁性分离；
(4)清洗:向离心管中加入ImL清洗缓冲液，放置于气浴振荡器中，温度调至37°C，转速180 rpm振摇10 min,磁性分离；
(5)洗脱:向离心管中加入500洗脱缓冲液，25°C 180 rpm振摇I h，磁性分离后收
集上清液标记为“洗脱”待用；即为含有目的蛋白神经氨酸酶的悬液。
[0013]此分离纯化过程中，所述磁粒、病毒粗提蛋白原样、缓冲体系的用量、配比及反应条件可达最佳效果，实际操作中可酌情调整，在以下所述的范围内也可较好的达到分离目的: 每毫克磁粒可对应各步缓冲液体积70-400 mL、蛋白原样1_4 mg ；
反应温度20-37 0C ；
转速:120-240 rpm
反应时间:封闭0.5-3 h，结合1.5-3 h，清洗8-15 min，洗脱0.5-3 h此外，注意反应容器的选择，反应体系最大体积不应超过反应容器最大容量的2/3，最小体积以不少于反应容器最大容量的1/4为宜。
[0014]上述步骤(4)清洗需要重复此步骤三次收集最后一次磁性分离的上清液。
[0015]上述反应器为烧瓶或烧杯或试管。
[0016]本发明的优点体现在:
4-氨基苯草氨酸与神经氨酸酶的结合能力随结合环境pH的变化而变化，它与神经氨酸酶结合的适宜pH是5.5,而当pH逐渐升高达到6.5时，结合物开始分解。
[0017]利用这一特性，本发明中选取pH为5.5的缓冲体系进行磁粒与NA的结合及杂质蛋白的清洗，选取PH为9.1的缓冲体系进行NA的洗脱，建立基于此种磁粒分离纯化流感病毒神经氨酸酶的方法。
[0018]对提取条件(磁粒用量，结合时间，洗脱时间)进行优化，验证方法特异性，并通过SDS-PAGE以及MALD1-TOF-MS技术进行鉴定。
[0019]本发明为流感病毒神经氨酸酶的分离纯化提供了一种行之有效的手段，既避免了基因工程方法获取的神经氨酸酶无法满足神经氨酸酶糖基化研究的缺陷，又解决了商品化草酸琼脂糖亲和柱分离神经氨酸酶操作程序复杂，价格昂贵，洗脱体积大，难以微量化等技术问题。该方法操作简便快捷、特异性高，对神经氨酸酶有着良好的提纯效果，还可扩展应用于其他复杂样本中NA的提取。本发明最终应用该方法对实验室现有8种毒株的神经氨酸酶进行分离纯化，为本实验后续的NA糖链谱的研究提取实验材料。
【专利附图】
【附图说明】[0020]图1为本发明流程不意图；
图2为第一步反应修饰原理图；
图3为第二步反应修饰原理图；
图4为磁粒用量与洗脱浓度关系示意图；
图5为结合时间与洗脱浓度关系示意图；
图6为洗脱时间与洗脱浓度关系示意图；
图7为特异性验证电泳结果图；
图8为电泳鉴定结果；
图9为质谱鉴定结果；
图10为Bradford法蛋白定量标准曲线。
【具体实施方式】
[0021]、仪器及材料
、主要试剂与材料
表2-1主要试剂与材料及其供应商
【权利要求】
1.一种分离纯化神经氨酸酶(禽流感病毒)的方法，其特征是:该方法将神经氨酸酶特异的竞争性抑制剂4-氨基苯草氨酸作为亲和配体，固定于环氧化磁性微粒表面，制备成对神经氨酸酶具有特异亲和力的功能化磁性微粒，并用此微粒与含有神经氨酸酶的流感病毒株以pH为5.5的缓冲体系结合、清洗；以pH为9.1的缓冲体系洗脱分离纯化神经氨酸酶。
2.根据权利要求1所述分离纯化神经氨酸酶(禽流感病毒)的方法，其特征是，所述制备成对神经氨酸酶有特异亲和力的功能化磁性微粒包括:提取含200 mg环氧化磁性微粒的悬液，将该环氧化磁性微粒修饰为4-氨基苯草氨酸功能化磁性微粒； 所述修饰包括: 第一步修饰:将上述悬液置于反应器内，用无水乙醇清洗；再将反应器置于磁性分离器上进行磁性分离，弃去上层中不含磁性微粒的清液； 称取0.1081g对苯二胺溶于50mL无水乙醇,充分溶解后转入反应器内；使环氧磁粒和对苯二胺充分混合、反应，将环氧化磁粒修饰成对苯二胺修饰磁粒；反应完成后，磁性分离，并弃去上清液； 第二步修饰:将上述反应完成后得到的对苯二胺修饰磁粒用无水乙醇清洗，再用超纯水清洗，换至新的反应器中，磁性分离后，弃去上层中不含磁性微粒的清液；
向烧瓶中加入50 mL pH 5.0~6.0的0.1~0.2M MES缓冲液，再加入0.1260g 二水草酸，搅拌使草酸充分溶解并与磁粒混合均匀，加入EDC 0.1970 g，NHS 0.1151 g，于4°C反应8小时以上，将对苯二胺修饰磁粒制成4-氨基苯草氨酸功能化磁粒； 反应完成后，磁性分离，弃去上清液；用超纯水清洗磁粒，定容至20 mL，转入试剂瓶，差量法称量计算此4-氨基苯草氨酸功能化磁粒悬液的固体物含量，贴签，4°C保存备用。
3.根据权利要求1所述分离纯化神经氨酸酶(禽流感病毒)的方法，其特征是:所述神经氨酸酶的流感病毒株来自接种的10日龄鸡胚尿囊液；该病毒株的颗粒悬浮于尿囊液中。
4.根据权利要求3所述分离纯化神经氨酸酶(禽流感病毒)的方法，其特征是，所述含有神经氨酸酶的流感病毒株使用前需要对该病毒株的颗粒进行裂解与蛋白粗提；所述裂解与蛋白粗提采用乙醚提取法。
5.根据权利要求1所述分离纯化神经氨酸酶(禽流感病毒)的方法，其特征是，该方法具体是， (1)磁粒的封闭:取一支2mL离心管，中向其中加入3mg4-氨基苯草氨酸磁粒，磁性分离，弃上清；然后向离心管中加入封闭缓冲液500 --L，混合均匀，后置于气浴振荡器中，37℃ 180 rpm 反应 30 min ； (2)磁粒的平衡与活化:上步反应完成后，将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，弃去上清液，每次加入I mL平衡缓冲液，清洗:再加入I mL结合缓冲液清洗磁粒； (3)样本与磁粒的结合:取一支新的离心管，加入乙醚处理过的病毒粗提蛋白5mg，按比例加入2X结合缓冲液与超纯水,使得体系结合缓冲液浓度为IX，体积为ImL ;标记为“原样”待用；取此溶液950--L加入装有上步已活化磁粒的离心管中，轻轻摇晃至混合均匀，置于气浴振荡器中37°C 180 rpm反应2h;反应完成后磁性分离； (4)清洗:向离心管中加入ImL清洗缓冲液，放置于气浴振荡器中，温度调至37V,转速180 rpm振摇10 min,磁性分离； (5)洗脱:向离心管中加入500--L洗脱缓冲液，25°C 180 rpm振摇I h，磁性分离后收集上清液标记为“洗脱”待用；即为含有目的蛋白神经氨酸酶的悬液。
6.根据权利要求5所述分离纯化神经氨酸酶(禽流感病毒)的方法，其特征是:所述步骤(4)清洗需要重复此步骤三次收集最后一次磁性分离的上清液。
7.根据权利要求6所述分离纯化神经氨酸酶(禽流感病毒)的方法，其特征是:所述反应器为烧瓶或烧 杯或试管。
【文档编号】C12N9/24GK103525785SQ201310438024
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】李铮, 马恬然, 钟耀刚, 胡圆, 杨刚龙, 赵菲 申请人:西北大学