可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏号为CCTCC?No：C2013132。该杂交瘤细胞的分泌产量高，其分泌得到的抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在视黄醇结合蛋白检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等，在特异性、灵敏度和检测率等方面较之传统的检测方法具有显著的优势。此外，本发明还涉及一种该杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体、该杂交瘤细胞及其单克隆抗体的应用。
【专利说明】可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及视黄醇结合蛋白免疫检测领域，尤其是涉及一种可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及应用。
【背景技术】
[0002]目前临床上用于肾功能损伤早期诊断的尿小分子蛋白有β2微球蛋白和RBP (视黄醇结合蛋白)。β2微球蛋白在ρΗ< 5.5时很不稳定，易降解，且β 2微球蛋白在尿液中的半衰期较短，在ΡΗ4.0环境中放置4小时后有70%的降解，而RBP在相同条件下仅有降解5%。因此，RBP相对于β 2微球蛋白在肾功能损伤诊断中更稳定，更可靠。
[0003]RBP是一种低分子蛋白，分子量约为21KD，主要由肝细胞合成，主要功能是将视黄醇从肝脏转运到上皮细胞并能与视网膜上皮组织特异性结合，为其提供维生素Α。肝脏中分泌的RBP-视黄醇聚合物与转铁蛋白形成稳定的蛋白复合物在血液系统中循环。RBP-视黄醇-转铁蛋白复合体在视黄醇释放后解体，RBP以游离的形式存在于血液系统，由肾小球滤过，再由近曲小管上皮细胞重吸收、降解。
[0004]血液中游离的RBP可以从肾小球滤过，其中99.9%经近曲小管上皮细胞重吸收、降解。正常情况下，尿液中RBP排泄量甚微(低于300ng/mL)。若肾小管病变，则重吸收功能下降，会导致尿液中的RBP大量上升。在肾小管损伤病人尿液中，RBP含量大于300ng/mL，一般可以达到正常人的5倍以上，严重者其尿液中的RBP含量甚至可以达到10000ng/mL。故尿液中RBP增高具有早期诊断意义，被认为是肾小管损伤的一个良好早期标志物，对RBP的检测已经被广泛应用于临床上对肾脏损伤的诊断中。
[0005]RBP的临床检测意义还包括急性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎、糖尿病性肾病和慢性肾功能衰竭疾病等，其血`清RBP的浓度水平均升高。同时RBP与肝脏病也有关系，RBP与血清胆红素、谷草转氨酶和碱性磷酸酶活力均显著负相关，坏死性肝硬化、胆汁性肝硬化及急、慢性肝炎患者的血清RBP水平均显著低于正常对照组。
[0006]传统的RBP的测定方法主要有酶联免疫法、放射免疫法及乳胶免疫比浊法。免疫比浊法因其试剂稳定，容易实现检测的高通量及操作自动化，且检测结果快速、准确、可靠，因此成为临床实验室最具前景的测定方法。
【发明内容】
[0007]基于此，有必要提供一种可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0008]此外，还有必要提供上述杂交瘤细胞或其分泌的单克隆抗体在医学检测领域的应用。
[0009]一种可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No:C2013132。
[0010]上述可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞在制备诊断肾脏损伤疾病或肝脏疾病的检测试剂或检测设备领域的应用。[0011]上述可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞在制备视黄醇结合蛋白检测试剂或检测设备领域的应用。
[0012]一种由上述可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
[0013]上述单克隆抗体在制备诊断肾脏损伤疾病或肝脏疾病的检测试剂或检测设备领域的应用。
[0014]上述单克隆抗体在制备视黄醇结合蛋白检测试剂或检测设备领域的应用。
[0015]一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，包括上述单克隆抗体。
[0016]在其中一个实施例中，所述视黄醇结合蛋白检测试剂盒包括第一试剂和第二试剂，其中，所述第一试剂包括30_60mmol/L Tris缓冲液、60_95mmol/L聚乙二醇、l_5mmol/L叠氮钠、6-13mmol/L乙二胺四乙酸钠以及l_5mmol/L牛血清白蛋白；所述第二试剂包括30-60mmol/L Tris缓冲液、结合有所述单克隆抗体的胶乳颗粒、l_5mmol/L吐温-20、0.5_3mmol/L叠氮钠、6_13mmol/L乙二胺四乙酸钠以及l_5mmol/L牛血清白蛋白。
[0017]上述杂交瘤细胞，命名为RBP-2B6，于2013年8月28日保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心(即中国典型培养物保藏中心)，保藏号是CCTCC No:C2013132。
[0018]上述杂交瘤细胞的分泌产量高，其分泌得到的抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在视黄醇结合蛋白检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等，在特异性、灵敏度和检测率等方面较之传统的检测方法具有显著的优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为当检测原为重组RBP抗原，包被浓度为2 μ g/mL时，RBP单抗效价测定结果图；
[0020]图2为实施例2中的检测试剂与对照试剂检测结果相关性图。
【具体实施方式】
[0021]下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用作进一步详细的说明。
[0022]本实施方式的可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心(CCTCC)，保藏号是CCTCC No:C2013132。该杂交瘤细胞可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体。该杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体可应用在制备视黄醇检测试剂或检测设备领域中，从而可广泛应用在制备诊断肾脏损伤疾病或肝脏疾病的检测试剂或检测设备领域中。
[0023]本实施方式还提供了一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其含有上述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，具体是将该单克隆抗体包裹在乳胶颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，校准品或待测样品中的视黄醇结合蛋白可与单克隆抗体乳胶颗粒发生凝聚反应，形成抗原抗体复合物而产生浊度，其浊度高低在一定量抗体存在时与样品中的视黄醇结合蛋白成正比。通过测定特定波长的吸光度值，参照校准曲线即可计算出待测样品中视黄醇结合蛋白的含量。具体在本实施方式中，该视黄醇结合蛋白检测试剂盒包括第一试剂和第二试剂。其中，第一试剂包括30_60mmol/L Tris缓冲液、60_95mmol/L聚乙二醇、l_5mmol/L叠氮钠、6-13mmol/L乙二胺四乙酸钠以及l_5mmol/L牛血清白蛋白；第二试剂包括30_60mmol/L Tris缓冲液、结合有所述单克隆抗体的胶乳颗粒、l-5mmol/L吐温-20、0.5_3mmol/L叠氮钠、6-13mmol/L乙二胺四乙酸钠以及l_5mmol/L牛血清白蛋白。其他所需的检测试剂可以
根据需要直接在实验室制备。
[0024]该单克隆抗体除了应用于上述检测剂盒外，还可以用于其他视黄醇结合蛋白检测试剂盒或设备中。本领域技术人员可以理解，将本实施方式的单克隆抗体直接或间接结合其他信号基团(如磁性微球、辣根过氧化酶等)，或将本实施方式的单克隆抗体作为包被抗体(例如ELISA)可用于其他形式的视黄醇结合蛋白检测试剂或设备中。
[0025]该杂交瘤细胞的分泌产量高，其分泌得到的抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在视黄醇结合蛋白检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等，在特异性、灵敏度和检测率等方面较之传统的检测方法具有显著的优势。
[0026]以下为具体实施例部分
[0027]实施例1杂交瘤细胞株的建立与抗RBP单克隆抗体的制备
[0028]1.抗原免疫
[0029]将重组RBP抗原(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0032 )等量与弗氏完全佐剂(外观:琥珀色细胞悬浮液；组份=Paraffin Oi 185%, MannideMonooleatel5%,Myco bacterium smegmatislmg/mL)混合，得到油状乳液。将该乳液以0.2mL的剂量皮下注射BALB/c小鼠(广州省实验动物中心，6周龄雌性，5只)背部位点，第一次免疫14天后腹腔增强免疫(等量抗原与弗氏不完全佐剂混合)，增强免疫到四针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求。
[0030]融合前3天，用相同剂量抗原腹腔注射追加免疫，免疫方法同上。
[0031]2.杂交瘤细胞株的制备
[0032](I)饲养细胞的制备
[0033]以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前I天，BALB/c鼠拉颈处死，75%酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm,离心5分钟，留沉淀，用RPMI1640筛选培养液(含HAT的RPMI1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度I X IO5个/mL,加入96孔板，150 μ L/孔，37°C，5%C02培养过夜。
[0034](2)免疫脾细胞的制备
[0035]小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI1640基础培养液重悬，如此重复三次，得到免疫脾细胞，计数。
[0036](3)骨髓瘤细胞的制备
[0037]小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI1640基础培养液重悬，如些重复三次，得到骨髓瘤细胞，计数。
[0038](4)细胞融合及HAT选择杂交瘤
[0039]将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:10比例混合，在50mL塑胶离心管内用RPMI1640基础培养液洗I次，1200rpm,离心8分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入lmL50%的PEG1500融合，融合I分钟后加入15mL的RPMI1640基础培养液终止细胞融合。lOOOrpm，离心5分钟。弃上清，用50mL的RPMI1640筛选培养液轻轻重悬，平分于10块96孔板，50 μ L/孔，37°C，5%C02培养。培养至第六天，换HAT培养液(含HAT的RPMI1640完全培养液)两次。
[0040](5)抗体的检测
[0041]用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释天然RBP(SRIPPS)，使其终浓度为5 μ g/mL。每孔0.1mL,加入96孔聚苯乙烯板，370C 2小时或4°C过夜。次日，用含10%小牛血清或1%脱脂奶粉的0.02M pH7.2PBS,0.15mL/孔，37°C封闭2小时，用于检测。融合后第七天，取细胞上清0.1mL于上述96孔检测板中，37°C 30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0032)，37°C 30分钟同上洗后，每孔加入IOOyL含0.1% (Μ/V)邻苯二胺，0.1% (V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37°C 15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μ L，测450nm吸收值。RPMI1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值的比3 2.0为阳性细胞孔。
[0042]分泌抗体阳性细胞孔以I个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆三次，扩大培养后，用含10%DMS0的培养液冻存，细胞密度为IO6个/mL。细胞融合一次共获得I株能稳定分泌抗体的细胞株，命名为RBP-2B6 (CCTCC No:C2013132)细胞株。
[0043]3.单克隆抗体的制备
[0044]选6-8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的降植烷；10天后腹腔注射I X IO6个杂交瘤细胞。接种细胞7-10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5-10mL腹水。收集腹水，离心取上清，放于-20 V冰箱保存。
[0045]取腹水上清，用3`倍体积的PBS稀释后滤纸过滤。将所得的滤液在lmL/min的流速下加到一个已用PBS平衡的蛋白G亲和层析柱(购自Amersham Biosciences公司)。然后用PBS以lml/min的流速洗涤未被蛋白G吸附的物质直至在OD28tlnm下的吸收值达到基线为止。再用0.1M的甘氨酸洗脱液(pH2.5)洗脱并回收该抗体。所回收的溶液用0.1M Tris(pH8.8)中和，通过超滤将抗体浓度调节到一个合适的浓度，_20°C分装冻存。
[0046]4.效价测定
[0047]以间接ELISA法检测，上述杂交瘤细胞培养上清效价1.22X 103,腹水上清效价1.02X 106。具体实验步骤如下:
[0048](I)包被:将免疫用的重组RBP抗原稀释至2 μ g/mL，100 μ L/孔加至酶标板，37 0C 2小时或者4°C过夜；
[0049](2)用洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350 μ L，停留20秒；最后拍干；
[0050](3)用洗涤液洗去包被液，用封闭液封闭，每孔150μ L，37°C放置1.5-2小时；
[0051](4)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350 μ L，停留20秒；最后拍干；
[0052](5)加样品:分别将稀释成不同梯度的细胞培养上清和腹水加入上述重组RBP抗原包被好的酶标板，100 μ L/孔，37°C反应I小时(同时做阴性对照孔和阳性对照孔)；
[0053](6)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350 μ L，停留20秒；最后拍干；
[0054](7)加辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG (用封闭液稀释6000倍)，100 μ L/孔，37°C反应I小时；[0055](8)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350 μ L，停留20秒；最后拍干；
[0056](9)加显色液TMB:即用即配，100 μ L/孔，37°C避光反应30分钟；
[0057](10)终止反应:于各反应孔中加入2M的硫酸，50 μ L/孔；
[0058](11)酶标仪读数:450nm、630nm波长测定，最终测定该杂交瘤细胞培养上清与重组视黄醇结合蛋白抗原的反应效价为1.22X 103，腹水抗体与重组视黄醇结合蛋白抗原反应效价为1.02 X IO6。
[0059]通过ELISA法，在450nm，630nm波长测定吸光度，用抗体亚类鉴定试剂盒，对RBP单抗类、亚类进行鉴定，表1为鉴定结果。
[0060]表1RBP单抗类型鉴定结果
[0061]
【权利要求】
1.一种可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No:C2013132。
2.如权利要求1所述的可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞在制备诊断肾脏损伤疾病或肝脏疾病的检测试剂或检测设备领域的应用。
3.如权利要求1所述的可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞在制备视黄醇结合蛋白检测试剂或检测设备领域的应用。
4.一种由如权利要求1所述的可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
5.如权利要求4所述的单克隆抗体在制备诊断肾脏损伤疾病或肝脏疾病的检测试剂或检测设备领域的应用。
6.如权利要求4所述的单克隆抗体在制备视黄醇结合蛋白检测试剂或检测设备领域的应用。
7.一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4所述的单克隆抗体。
8.如权利要求7所述的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括第一试剂和第二试剂，其中，所述第一试剂包括30-60mmol/L Tris缓冲液、60_95mmol/L聚乙二醇、l-5mmol/L叠氮钠、6_13mmol/L乙二胺四乙酸钠以及l_5mmol/L牛血清白蛋白；所述第二试剂包括30-60mmol/L Tris缓冲液、结合有所述单克隆抗体的胶乳颗粒、l_5mmol/L吐温-20、0.5-3mmol/L叠氮钠`、6_13mmol/L乙二胺四乙酸钠以及l_5mmol/L牛血清白蛋白。
【文档编号】C12N5/20GK103525769SQ201310470607
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】何志强, 王刘花, 彭亮, 刘莉莉 申请人:深圳市菲鹏生物股份有限公司