提高l-精氨酸发酵产酸的工艺的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种提高L-精氨酸发酵产酸的工艺。所采用的技术方案是：采用黄色短杆菌ATCC21493（SDR）为出发菌，经NTG处理，诱变得到TA189菌株，该菌株可以利用葡萄糖直接合成精氨酸，而且产酸能力强，菌种生产能力和发酵工艺控制达到的指标，其综合水平达到国内领先水平。本发酵工艺结合氨基酸和抗生素的发酵工艺特点，采用趋势控制，中途补料、补糖工艺严格控制，始终菌体的活力，得到较高的产酸水平。
【专利说明】提高L-精氨酸发酵产酸的工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程【技术领域】，具体地说是一种提高L-精氨酸发酵产酸的工艺。【背景技术】
[0002]L-精氨酸是氨基酸中最重要的品种之一，在医药、营养保健、食品等领域应用广泛、需求量大，对于治疗生理功能、心血管疾病、激励免疫系统、维持婴儿的营养平衡、促进人体解毒等都具有良好的疗效，被专家称为是机体内运输和贮存氨基酸的重要载体，在肌内代谢中极为重要。L-精氨酸具有以下功能:L-精氨酸是一氧化氮在体内的最主要前体，一氧化氮是内源性细胞舒展因子，能扩张小动脉血管(如阴茎的血管，使他坚挺起来)。补充L-精氨酸促进ESRF的生成可防治某些心血管病。可防止胸腺退化，补充L-精氨酸能增加胸腺的重量，促进胸腺中淋巴细胞与CD细胞的增长，提高免疫力。在肌肉的代谢过程中非常重要，它能促进肌肉的增加与减少脂肪，因此在减肥中精氨酸起着重要作用。L-精氨酸及其盐类广泛用作氨中毒性肝昏迷的解毒剂和肝功能的促进剂，添加L-精氨酸的功能性口服液或保健饮料具有保肝、护肝功能。
[0003]L-精氨酸的生产方法有水解法和发酵法。我国现有的生产厂家目前大多仍主要依靠蛋白质水解法来生产L-精氨酸，该法操作费时、收率低，工艺稳定性不好且环境污染严重，不适于大规模生产。发酵法克服了蛋白质水解提取法所存在的工艺复杂和污染大等缺点，具有广阔的发展前景。但是，以微生物发酵法生产L-精氨酸，国内大多数发酵生产技术的产酸水平较低、成本较高，生产水平和产量远不能满足国内市场的需求。因此，开展提高精氨酸发酵产率的研究具有极其重要的意义。
[0004]由此可见，精氨酸从功能和需求上都具有十分广阔的市场前景。基于上述状况，国家科技部把L-精氨酸列入“十五”重点公关项目是十分正确、十分必要的，由于种种原因，“十五”以来，L-精氨酸发酵法产酸水平较低(最大3.8%)，因而未能工业化生产，国家科技部又将发酵法生产L-精氨酸作为“十二五”重点攻关项目。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种提高L-精氨酸发酵产酸的工艺。
[0006]所采用的技术方案是:采用黄色短杆菌ATCC21493 (SDk)为出发菌，经NTG处理，诱变得到TA189菌株，该菌株可以利用葡萄糖直接合成精氨酸，而且产酸能力强，菌种生产能力和发酵工艺控制达到的指标，其综合水平达到国内领先水平。
[0007]本发酵工艺结合氨基酸和抗生素的发酵工艺特点，采用趋势控制，中途补料、补糖工艺严格控制，始终菌体的活力，得到较高的产酸水平。
[0008]一种提高L-精氨酸发酵产酸的工艺步骤如下:
菌种选育:从黄色短杆菌ATCC21493 (SDe)为出发菌，在选择性培养基中加一定浓度的AHV ( α -氨基-β -羟基戊酸)或2-ΤΑ ( α -噻唑丙氨酸)，诱变得到ΤΑ174 (SD\ AHVe,Z-TAe)菌株；经过 NTG 处理得到 ΤΑ188 (SDK、AHVK、2-TAK、L-His0 菌株；把 TA188 再经过 NTG处理后筛选出突变株TA189 (SDK、AHVK、2-TAK、L-His_)菌株，最后发酵产酸。
[0009]作为优选，所述黄色短杆菌TA174的筛选:
出发菌株:黄色短杆菌ATCC214939 (SDe)
所述的菌种，筛选所用诱变培养基的组成为:
培养基
a、完全培养基:蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、酵母膏0.5%、氯化钠0.5%、琼脂粉2.0%，PH7.0-7.2 (试纸)，灭菌温度121°C，灭菌时间20分钟。
[0010]b、选择抗性菌株的基本培养基:
葡萄糖 1.0%、(NH4)2SO40.3%、KH2PO40.1%、K2HPO4.3Η200.3%、MgSO4.7Η200.05%、FeSO4.7Η20 0.002%、MnS04.H2O0.002%、VH5(^g/l、Vbi.HC120(^g/l，琼脂粉 2.0%,PH6.8-7.0，121°C 灭菌 20 分钟。
[0011]选择性培养基加一定浓度的AHV ( α -氨基-β -羟基戊酸)或2_ΤΑ ( α -噻唑丙氨酸)
C、种子培养基葡萄糖 3 %、尿素 0.25 %、K2HPO4.3Η200.15 %、KH2PO40.05 %、MgSO4.7Η20 0.04 %、维生素仏25邶/1、(:.5丄2.5%卬!17.0-7.2。115°C灭菌 15 分钟。装液量20ml/250ml三角瓶或150ml/1000ml三角瓶。
[0012]发酵产酸:
发酵培养基葡萄糖 12.5 %、(NH4)2S045-7 %、K2HPO4.3Η200.05 %、KH2PO4 0.10%、MgSO4.7Η200.05 %、硫胺素盐酸盐 100ug/l、C.S.L1.2 % (分消)、CaC035 % (分消)，PH7.0-7.2，装液量20ml/500ml三角瓶。在摇瓶阶段每瓶加苯酚红2_4滴，115°C灭菌15分钟；
作为优选，所述该菌的诱变方法及抗性菌检出:
取活化的培养基(I)斜面菌苔(30~33°C培养18~24小时)，(Φ 15X 150斜面试管4支)接入装30ml 1/30M磷酸缓冲液及玻璃珠的250ml三角瓶中振摇15min使菌体分散成单细胞，加入事先溶解的NTG使终浓度25(T500ug/ml，30°C振摇处理30min后吸0.5ml入液体完全培养基(I) (25ml/250ml三角瓶)中30°C振荡培养至培养液微混(对数生长初期)，不稀释涂布在选择性培养基平板上(每皿0.1~0.2ml)，30°C培养3飞天，挑出大菌落即视为抗性菌。
[0013]附:1/30M磷酸缓冲液的配制(ρΗ7.0)
甲液:Na2HP04.12H20 23.9g/l
乙液:NaH2P04.2H20 10.4g/l
使用时甲液61 ml加乙液39 ml稀释成200 ml。
[0014]附:1 / 30M磷酸缓冲液的配制(ΡΗ7.0)
甲液:Na2HP04.12H20 23.9g / I
乙液:NaH2P04.2H20 10.4 g / I 使用时甲液61ml加乙液39ml稀释成200ml.TA 174的发酵产酸统计:
①、30L自控罐发酵产酸成绩统计
【权利要求】
1.一种提高L-精氨酸发酵产酸的工艺，其特征在于：采用黄色短杆菌ATCC21493(SDk) 为出发菌，经NTG处理，诱变得到TA189菌株，该菌株可以利用葡萄糖直接合成精氨酸；具体工艺步骤如下：菌种选育：从黄色短杆菌ATCC21493 (SDE)为出发菌，在选择性培养基中加一定浓度 的AHV (a-氨基-运-羟基戊酸）或2-TA ( a -噻唑丙氨酸)，诱变得到TA174 (SDK、AHV\ Z-TAe)菌株；经过 NTG 处理得到 TA188 (SDK、AHVK、2-TAK、L_His0 菌株；把 TA188 再经过 NTG 处理后筛选出突变株TA189 (SDK、AHVK、2-TAK、L-His_)菌株，最后发酵产酸。
2.根据权利要求1所述的一种提高L-精氨酸发酵产酸的工艺，其特征在于：所述黄色 短杆菌TA174的筛选：出发菌株：黄色短杆菌ATCC214939 (SDE)所述的菌种，筛选所用诱变培养基的组成为：培养基a、完全培养基：蛋白胨1.0%、牛肉膏1. 0%、酵母膏0. 5%、氯化钠0. 5%、琼脂粉2. 0%， PH7. 0-7. 2 (试纸)，灭菌温度121°C，灭菌时间20分钟；b、选择抗性菌株的基本培养基：葡萄糖 1. 0%、(NH4)2S040. 3%、KH2P040. 1%、K2HP04 ? 3H200. 3%、MgS04 ? 7H200. 05%、 FeS04 ? 7H20 0. 002%、MnS04 ? H200. 002%、VH50Pg/l、VB1 ? HC1200l^g/l,琼脂粉 2. 0%, PH6. 8-7. 0，121°C 灭菌 20 分钟；选择性培养基加一定浓度的AHV ( a -氨基-0 -羟基戊酸)或2-TA ( a -噻唑丙氨酸)c、种子培养基葡萄糖 3 %、尿素 0. 25 %、K2HP04.3H200. 15 %、KH2P040 . 05 %、 MgS04. 7H20 0. ，04 %、维生素 HH25ug/l、C. S. L2. 5 %，pH7. 0-7. 2。
3.115°C灭菌15分钟。
4.装液量20ml/250ml三角瓶或150ml/1000ml三角瓶；发酵产酸：d、发酵培养基葡萄糖 12. 5 %、（NH4)2S045-7 %、K2HP04.3H200. 05 %、KH2P04 0. 10 %、MgS04. 7H200. 05 %、硫胺素盐酸盐 100ug/l、C. S. LI. 2 % (分消）、CaC035 % (分消）， pH7. 0-7. 2，装液量 ，20ml/500ml 三角瓶。
5.在摇瓶阶段每瓶加苯酚红2-4滴，115°C灭菌15分钟。
6.根据权利要求1所述的一种提高L-精氨酸发酵产酸的工艺，其特征在于：所述该菌 的诱变方法及抗性菌检出：取活化的培养基（1)斜面菌苔（30?33°C培养18?24小时)，（(M5X150斜面试管4支) 接入装30ml 1/30M磷酸缓冲液及玻璃珠的250ml三角瓶中振摇15min使菌体分散成单细 胞，加入事先溶解的NTG使终浓度25(T500ug/ml，30°C振摇处理30min后吸0. 5ml入液体 完全培养基（1) (25ml/250ml三角瓶)中30°C振荡培养至培养液微混(对数生长初期)，不稀 释涂布在选择性培养基平板上(每皿0. ro. 2ml)，30°C培养3飞天，挑出大菌落即视为抗性 菌。
【文档编号】C12N1/20GK103540626SQ201310531269
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年11月1日 优先权日:2013年11月1日
【发明者】高法民, 高树营, 李令娣, 王威 申请人:山东民强生物科技股份有限公司