微小分子RNA-508-5p作为抗肿瘤标志物的用途
【专利摘要】本发明提供一种miRNA-508-5p对肝癌和胃癌细胞株新陈代谢的调控作用，很可能成为预防与治疗肿瘤的标志物。越来越多的证据表明，microRNA可作为一种癌基因或抑癌基因，参与调控多种癌症的发生和发展过程。本发明通过构建慢病毒侵染肿瘤细胞模型的实验证明，miRNA-508-5p对肿瘤细胞株HepG2和SGC7901的增殖、迁移和侵袭等具有明显抑制作用，并且促进其细胞的凋亡，具有调控细胞周期及新陈代谢的作用，因此miR-508-5p很可能成为肿瘤预防与治疗的全新靶点；并且通过靶基因删选软件及双荧光素酶报告系统证实miR-508-5p发挥细胞调控作用，是通过特异性靶向抑制癌基因S-期激酶相关蛋白2基因(Skp2)的表达。
【专利说明】微小分子RNA-508-5p作为抗肿瘤标志物的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种内源性的非编码小RNAs的新用途，尤其涉及miR-508-5p在预防与治疗胃癌和肝癌疾病中作为新的肿瘤标志物以及抗肿瘤药物研制中的用途。
【背景技术】
[0002]胃癌是常见的危害人类健康的恶性肿瘤，其病死率居我国恶性肿瘤之首，迄今病因不明，临床治疗效果不佳；原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率逐年增长。因此开展胃癌、肝癌发病机制及临床治疗的研究是减轻其危害的根本途径。
[0003]MicroRNA (miRNA)是近年来发现的一类内源性非编码单链RNA，其长约为18~25个核苷酸。miRNA通过Watson-Crick碱基互补匹配原则,对革EmRNA进行降解或抑制翻译来调节蛋白的表达。据预测，人类约含有1000个miRNA，参与调控超过30%的蛋白编码基因，在生物体的生长、发育、分化等方面起着重要的作用。miRNA的异常表达，参与肿瘤的各种生物学过程，包括肿瘤细胞增殖、凋亡和迁徙、侵袭等。越来越多的证据表明，miCToRNA可作为一种癌基因或抑癌基因，参与调控多种癌症的发生和发展过程。依此推断，miRNA可作为一种癌基因或抑癌基因。
[0004]成熟的miRNA通过和其靶基因3’ UTR结合，从而降解其靶mRNA或阻碍其靶mRNA的翻译。通过miRBase检索成熟miR-508_5p序列信息，TargetScan、miRanda等进行革巴基因预测，miR-508-5p靶向抑制预测靶基因SKP2的表达。Skp2基因在各种人类恶性癌症中都是过表达的，包括大肠癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌、以及胃癌等，并且预后较差。Skp2的大量表达可促进癌细胞的细胞周期进展，与多种恶性肿瘤的发生和发展密切相关。SKP2过表达与直肠癌放化疗治疗预后不良直接相关，成为高潜力的治疗祀点。
[0005]在众多的miRNA中，miR-508已经被研究证实在胃癌、肝癌、肾癌和卵巢浆液性癌中表达异常下调，并很可能参与肿瘤的进程，成为潜在的抑癌基因，而目前miR-508-5p在胃癌、肝癌等肿瘤细胞中的调控作用机制及对其增殖与凋亡进程影响的研究仍不清楚，因此，开发以miR-508-5p为策略的胃癌和肝癌疾病的预防、诊断和治疗的基础研究和抗肿瘤药物研究具有重要的意义和应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种微小分子RNA-508-5p (miR-508_5p)在预防与治疗胃癌和肝癌疾病及抗肿瘤药物中的作用，所述miR-508-5p的核苷酸序列如下所示:5， -UACUCCAGAGGGCGUCACUCAUG-3，。
[0007]本发明的研究基础:
[0008]1.免疫组化法显示Skp2蛋白在中低分化胃腺癌中明显高表达，而在正常胃粘膜中Skp2蛋白几乎不表达，并且其表达水平与胃癌临床病理特征呈正相关，与肿瘤大小，淋巴结转移，浸润深度，分化程度等临床病理特征密切相关。相反，通过qRT-PCR检测发现miR-508-5p在中低分化胃腺癌组织中表达水平相较于在正常胃粘膜中表达水平明显下调，并且随着病理分级越严重，表达量成逐级下调的正相关趋势，qRT-PCR检测结果和芯片数据
结果一致。
[0009]2.本发明通过TargetScarumiRanda等预测软件对miR-508_5p进行祀基因预测，通过双荧光素酶验证了其对Skp2具有特异性靶向抑制作用。
[0010]3.本发明成功包装了含有miR-508-5p小颗粒的慢病毒上清，病毒滴度达到lxl07TU/mlo将计算好的浓缩病毒上清液侵染肿瘤细胞，构建细胞模型，通过westernblot和相对定量qRT-PCR检测方法，同时证实了 miR-508_5p过表达能够特异性明显抑制Skp2mRNA (P < 0.05)和蛋白表达水平。
[0011]4.本发明通过MTT、Hoechst染色和流式细胞术同时证明，miR-508_5p通过靶标Skp2的表达，下调其在肿瘤细胞高表达的水平，调控细胞周期，阻止细胞G1/S期转换而有效抑制细胞的增值，促进肿瘤细胞的凋亡。
[0012]5.本发明同时从划痕实验和transwell细胞迁移和侵袭实验，证实了 miR-508_5P能有效抑制肿瘤细胞侵袭、水平迁移、垂直迁移和细胞自愈能力。
[0013]6.本发明表明microRNA在临床实践中有非常重要的意义，将成为新一代的肿瘤生物诊断标志物和用于肿瘤治疗的分子靶标。尤其是开辟了以miR-508-5p为主的肿瘤疾病全新靶标的研究，也为研制抗肿瘤新药开辟新的途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1显示了免疫组化对胃癌组织中Skp2蛋白进行定量与定位，证实Skp2在胃癌组组织中高表达。
`[0015]图2显示了提取福尔马林固定后石蜡包埋组织中RNA，反转录为cDNA，运用q-RTPCR方法检测miR-508-5p在胃腺正常组织和癌变组织中表达情况。
[0016]图3显示双荧光素酶报告系统验证miR-508_5p靶向抑制Skp2荧光素酶活性。
[0017]图4显示浓缩病毒上清液侵染肿瘤细胞，通过半定量RT-PCR，western blot和相对定量qRT-PCR检测方法，同时证实了 miR-508-5p过表达能够特异性明显抑制Skp2mRNA(P< 0.05)和蛋白表达水平。
[0018]图5显示MTT实验验证了 miR-508-5p明显抑制肿瘤细胞H印G2和SGC7901细胞的增殖。图6显示hoechst染色实验验证了 miR-508-5p明显促进肿瘤细胞H印G2和SGC7901细胞的凋亡。
[0019]图7显示Transwell实验验证了 miR-508_5p明显抑制肿瘤细胞H印G2和SGC7901细胞的迁移和侵袭。
【具体实施方式】
[0020]1.采用免疫组化的方法检测癌基因SKP2基因表达情况。收集宁夏医科大学总医院病理科2013-2月到2013-8月期间中低分化胃腺癌病人福尔马林固定后石蜡包埋的组织(FFPE) 12例，以及正常胃粘膜病人福尔马林固定后石蜡包埋的组织(FFPE) 10例，连续切片，4um厚，经过脱蜡水化，ImM EDTA(PH9.0)抗原修复，H202消除内源性过氧化物酶，10%山羊血清封闭，鼠抗人SKP2 —抗孵育4°C过夜，羊抗鼠SKP2 二抗37°C孵育Ih.。采用DAB染色试剂盒对阳性区域染色，镜下控制染色程度，最后苏木素复染，HCL-酒精分化，氨水返蓝，梯度酒精脱水，透明封片。
[0021]2.石蜡组织RNA抽提和qRT-PCR。收集组织同上，采用FFPE RNA IsolationKit (OMEGA)从石蜡组织中提取RNA，运用q-RT PCR方法检测miR-508_5p在胃腺正常组织和癌变组织中表达情况。连续切片4-6片，IOum厚，二甲苯脱蜡，HiBind? RNAMicroElute柱子分离纯化RNA,按照promege反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。U6作为内参基因，结果采用相对定量法，公式为2_ΛΛσ。
[0022]3.pSicoR-miR-508-5p 重组慢病毒载体及 pMIR-R印ort-SKP2_3’ UTR 表达载体的构建与鉴定。将经过Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切的pSicoR质粒，以及经过MIU I和Spe I限制性内切酶双酶切的pMIR-R印ort质粒，用12g/L的琼脂糖凝胶跑电泳并对目的条带进行胶回收，分别将线性化的pSicoR质粒与双链miR-508-5p DNA片段连接，将线性化的pMIR-R印ort质粒与SKP23’_UTR连接，反应条件为22°C，2h。将连接产物转化到大肠杆菌TopiO感受态细胞，挑取单菌落，摇菌，提取质粒DNA，分别用Xba 1、Xho I及MIU 1、SpeI限制性内切酶双酶切鉴定并测序。
[0023]4.双荧光素酶报告系统。将HEK-293T细胞接种于96孔板，使转染时细胞密度达到 I X lOVmL。将 pSicoR-miR-508-5p 过表达载体和 pMIR-R印ort-SKP2_3’ UTR 载体共转染至 293T 细胞中，同时共转染 pMIR-R印ort-SKP2-3’UTR mut 载体及 miR-508_5pinhibitor(5’ -CAUGAGUGACGCCCUCUGG AGUA-3’ )做对照。每组共转染海蜃荧光素酶(PRL-TK)做为内参，转染试剂为Tranglipid Transfection Regent2000。转染48h后，突光倒置显微镜下观察绿色荧光发光情况，并裂解细胞，按照promega双荧光素酶试剂盒说明书进行操作，所用仪器为微孔板发光分析仪。
[0024]5.包装慢病毒建立 肿瘤细胞模型。在6孔细胞培养板中接种约IXlO6个HEK-293T细胞，每孔加入2mL含10% FBS DMEM完全培养基，37°C,5% C02培养24h后，细胞密度达到80 %~90 %时，按照TransLipid Transfection Reagent说明书，将三质粒系统(pSicoR-miR-508-5p 过表达载体 1.5 μ g，pVSVG0.45 μ g, Δ 8.911.05 μ g)共转染至ΗΕΚ-293Τ细胞中，收集转染48h和72h后的上清液。4°C 3000g离心lOmin，去除细胞碎片，然后将上清用0.45 μ m的PVDF滤膜过滤，_80°C分装保存。运用倍比稀释原则对病毒进行滴度测定，侵染肿瘤细胞系HepG2和SGC7901。
[0025]6.Western blot analysis。慢病毒侵染细胞同上，48h后观察GFP的表达情况，按照凯基提全蛋白试剂盒说明书提全蛋白，_80°C分装保存。提取的蛋白进行BCA法定量。SDS-PAGE分离，半干转至PVDF膜，50g/L脱脂奶粉封闭，4°C过夜后，加入兔抗的SKP2抗体(1:100)室温摇晃孵育2h后4°C过夜，TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(l:5000)孵育2h，充分洗膜后利用ECL化学发光法进行暗室曝光。
[0026]7.MTT检测细胞增殖情况。慢病毒侵染细胞同上，24、48、72h后终止刺激。更换无血清培养液，每孔90 μ L，加入50 μ L MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h，加入150 μ L DMSO溶解结晶。酶联免疫检测仪检测490nm的吸光度(A490)值。同时设置调零孔和对照孔，每组设定3复孔实验结果用柱状图或不同时间段折线图表示。
[0027]8.Hoechst染色检测细胞凋亡情况。6孔板放置无菌细胞爬片，接种合适密度的肿瘤细胞，
[0028]慢病毒侵染后48h，加入固定液，PBS清洗后，每孔加入0.5ml Hoechst33258染色液，避光染色5min。去染液，PBS洗两遍，滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的爬片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。荧光显微镜检测，激发波长350nm左右，发射波长460nm左右。计数蓝白色的细胞核(凋亡细胞)数量。
[0029]9.Transwell实验检测细胞迁移和侵袭情况。细胞侵袭实验=Matrigel基质胶来源于BD公司，首先将分装冻存在_20°C的新鲜Matrigel在冰上解冻并按照体积比1:8与无血清DMEM培养基配置成混悬液,包被TranswelI (孔径8um)小室:用无菌镊子将Transwell小室放入24孔细胞培养板，将制备好的Matrigel混悬液按70ul/室加入24孔板，放入细胞孵育箱中30min,取出后在超净工作台上风干30min,在Transwell小室的下室内加入500ul含10% FBS的DMEM培养基，上室中加入制备好的细胞悬液IO4/孔，细胞常规培养48h，以镊子小心将Transwell小室取出，弃去上室培养基，用无菌棉签轻将上室内面残余的细胞及Matrigel胶刮去，滴加90%乙醇在小室的外侧面，固定lOmin，0.1 %结晶紫染色5min，正置显微镜镜下采集照片，随机选取5个高倍镜视野，计数穿膜的细胞数，并进行统计分析。细胞迁移实验类似，除了不用铺`Matrigel基质胶，上室接种2xl04/孔细胞，常规培养24h。
【权利要求】
1.MiRNA-508-5p通过抑制癌基因Skp2的表达，在预防与治疗胃癌和肝癌等疾病中作为肿瘤标志物的作用。
2.根据权利要求1所述的用途，miR-508-5p在肿瘤细胞过表达对相关肿瘤的调控作用和相关疾病药物中的作 用。
【文档编号】C12Q1/68GK103805693SQ201310548573
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】徐广贤, 魏军, 张爱君, 白静 申请人:宁夏医科大学