传染性胰脏坏死病病毒标准样品及其制备方法
【专利摘要】本发明公开传染性胰脏坏死病病毒标准样品及其制备方法，其属于检测用病毒样品及其制备方法【技术领域】，具体包括即先将传染性胰脏坏死病病毒分离株经特异性PCR方法及ELISA试验检测，通过特异序列测定分析后，进行病毒增殖和TCID50滴度测定，再通过病毒培养物加入蔗糖脱脂奶粉冻干，均匀性和稳定性测试后，进行定值即为成品。传染性胰脏坏死病病毒标准样品成品为冻干粉末状，1mL/支，安瓿瓶真空包装，其为定性样品，用于该病毒检测的质量控制、新方法研制等。对积极开展我国水生动物及其产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。
【专利说明】传染性胰脏坏死病病毒标准样品及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于检测用病毒培养物标准品及其制备方法【技术领域】，具体涉及IPNV标准样品及其制备方法。【背景技术】
[0002]传染性膜脏坏死病病毒(InfectiousPancreatic Necrosis Virus, IPNV),为双股核糖核酸类型，病毒颗粒呈六角形或近似圆形，20面体，直径50-72纳米，少数可大到75-110纳米，有单层衣壳，没有囊膜，有92个壳粒。对乙醚、氯仿等脂溶剂、胰酶及乙二胺四乙酸不敏感，对甘油也很稳定，对热和酸稳定。可以在多种冷水性鱼类的细胞株中增殖，并使细胞产生病变；而在温水性鱼类的细胞株中不增殖，也不出现细胞病变。敏感细胞接种病毒后，在15°C _25°C均能出现细胞病变，最适温度为15-20°C。该病毒现有VR299、Sp、Ab、He等不同血清型。传染性膜脏坏死病(Infectious Pancreatic Necrosis, IPN)是由传染性胰脏坏死病病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus, IPNV)引起的危害极其严重的一种鱼病，该病是世界性鱼病，主要危害溪鳟、虹鳟、克氏鲑、红克鲑、银大马哈鱼、枇杷鳟、红大马哈鱼等鱼苗和幼鱼。最早发生在加拿大、美国，后来在丹麦、法国、希腊、英国、德国、挪威、意大利、瑞典、日本等国发生流行，本世纪80年代又传入朝鲜、我国台湾省及东北、山西、山东、甘肃等养殖虹鳟地区。在我国山西省某虹鳟养殖场于1986年和1987年有过二次大流行，造成90%的虹鳟稚鱼死亡，东北地区也有过流行。该病往往属于急性流行，死亡率高达50% -100%，而20周龄以上的幼鱼一般不发病。此病常在水温10°C -15°C时流行，IO0C以下或15°C以上发病少，而且病情较轻，死亡率低。发病后残存未死的，可数年以上用到终身成为带毒者，并通过粪例、鱼卵、精液排出病毒，继续传播。自80年代该病传入我国以来，随着进出口贸易的急剧增加，IPNV已经成为口岸水生动物及其产品的检疫对象。
[0003]实验室的质量控制一直是人们关注的事情，传染性胰脏坏死病已有国际或国内的标准方法。然而标准方法的使用并不总能保证测试结果的良好的重复性，针对内部质量控制，许多实验室使用自己的标准样品，这种样品制备特别费时，进一步来讲个体的内部标准样品与不同的实验室结果的比对是不可能的。为了帮助实验室完成好的质量保证，辽宁出入境检验检疫局从2005年就开始做这项工作。本标准样品的研制成功，不仅为检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。
【发明内容】
[0004]本发明的技术方案为，先将传染性胰脏坏死病病毒分离株经特异性PCR方法及ELISA试验检测，通过特异序列测定分析后，进行病毒增殖和TCID5tl滴度测定，再通过病毒培养物加入蔗糖脱脂奶粉冻干，均匀性和稳定性测试后，进行定值即为成品。
[0005]本发明所涉及的传染性胰脏坏死病病毒标准样品的来源是:辽宁地区实验室分离株，IPNV毒株由辽宁出入境检验检疫局的实验室分离保存，毒株名称:IPNV-DL。(发表的相关文章:胡晓利，李伟，肇慧君，吴斌.虹鳟鱼传染性胰脏坏死病病毒的分离与鉴定[J].中国动物检疫，2012，29 (3):27-30)。
[0006]本发明为了完成本项标准样品的制备工作，辽宁出入境检验检疫局成立了研制工作小组，IPNV标准样品制备工艺流程见图1。
[0007]本发明一方面涉及一种传染性胰脏坏死病病毒标准样品的制备方法，其步骤包括:
[0008]a.1PNV-DL毒株感染CHSE-214细胞获得病毒增殖液；
[0009]b.将步骤a中获得的病毒增殖液低温真空冷冻干燥制备成混合冻干粉；
[0010]c.检测步骤b中获得的混合冻干粉样品均匀性、稳定性后定值并分装。
[0011]本发明的上述技术方案涉及的传染性胰脏坏死病病毒标准样品的制备方法，步骤a包括:将已长满单层的CHSE-214细胞用0.05%胰酶消化，悬浮于含10%胎牛血清的M199培养基中，以I~2X IO6个细胞/细胞瓶分装，待细胞长至培养单层80%面积时，倒掉含10%胎牛血清的M199培养基，加入200 μ L步骤a中的感染IPNV-DL病毒的组织病料稀释液的上清液，20°C感作lh，再用无血清的M199培养基清洗两次，覆盖含1%甲基纤维素、2%血清的M199维持液；20°C低温培养箱继续培养，直至细胞病变达到80%时，反复冻融3次后，40C，lOOOOrpm，离心lOmin，得上清液即为IPNV-DL病毒增殖液；
[0012]本发明的上述技术方案涉及的传染性胰脏坏死病病毒标准样品的制备方法，其所述步骤b中低温真空冷冻干燥冻干保护剂为:按蔗糖:去离子水的重量体积比为5%，脱脂奶粉:去离子水的重量体积比20%配制，108°C高压灭菌15min。
[0013]本发明的上述技术方案涉及的传染性胰脏坏死病病毒标准样品的制备方法，其所述步骤b中低温真空冷冻干燥条件:将IPNV-DL病毒增殖液经6000rpm，离心IOmin去除细胞碎片后，保留上清液，在无菌操作条件下按1:1体积比和冻干保护剂混合，在_40°C冰柜中预冻24h，在设定的冻干条件进行冻干，其中所述的设定的冻干条件为冷肼温度为_80°C，真空度30mtorr，冻干时间24h ；
[0014]本发明的上述技术方案涉及的传染性胰脏坏死病病毒标准样品的制备方法，其所述步骤a中感染IPNV-DL病毒的组织病料稀释液为:用M199细胞培养液将感染IPNV-DL病毒的组织病料样品匀浆、依次稀释成1:10、1:100及1:1000三个稀释度。
[0015]本发明的上述技术方案涉及的传染性胰脏坏死病病毒标准样品的制备方法，其所述步骤a中获得病毒增殖液TCID5tl为10_8__5/0.lmL。
[0016]本发明另一方面涉及一种由上文所述方法制备的传染性胰脏坏死病病毒标准样品O
[0017]利于本发明上述技术方案所述方法制备传染性胰脏坏死病病毒标准样品，即先将传染性胰脏坏死病病毒分离株经特异性PCR方法及ELISA试验检测，通过特异序列测定分析后，进行病毒增殖和TCID5tl滴度测定，再通过病毒培养物加入蔗糖脱脂奶粉冻干，均匀性和稳定性测试后，进行定值即为成品。传染性胰脏坏死病病毒标准样品成品为冻干粉末状，ImL/支，安瓿瓶真空包装，其为定性样品，用于该病毒检测的质量控制、新方法研制等。应在生物安全II级条件下，加入2mL超纯水进行水化，待样品完全溶解后即可使用，用完之后立即放入-20°C冰箱保存。避光、-20°C条件贮存，室温可存放30天。产品性质:乳白或淡黄色粉末。[0018]均匀性检验:在制备的标准样品中随机取8份样品，每个样品分为2个小样，根据GB15805.1-2008传染性胰脏坏死病病毒检疫方法中的IPNV ELISA法，将测定结果进行分析统计，结果显示为无显著性差异，即所测样品是均匀的。
[0019]稳定性检验:在两种温度类型条件下，对标准样品进行稳定性试验(GB15805.1-2008传染性胰脏坏死病病毒检疫方法中的IPNV ELISA法):一种是在贮存温度(-200C )下的稳定性试验，随机取24份样品(样品A和B)，每个月检测2份，共计12个月；另一种是在较高的温度(模拟样品的运输条件4°C)下的稳定性试验，样品取24份，每I天检测2份共计12天。将测定结果分析统计，无显著性差异即所测样品是均匀的、稳定的。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1.1PNV-DL标准样品制备工艺流程。
[0021]图2.1PNV-DL PCR扩增结果，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示扩增出224bp大小的片段，与预期相符。1:DL2000Marker ;2~7 =PCR扩增产物扩增出224bp大小的片段；8:阴性对照。
[0022]图3.PCR扩增产物测序后与GENBANK上公布的多株IPNV核苷酸序列进行比对分析，序列比对结果显示扩增片段的核苷酸与多株IPNV序列同源性较高。
[0023]图4.CHSE-214细胞随感染IPNV-DL时间的增长细胞病变检测图；图4a:正常 CHSE-214 细胞 100X ;图 4b:CHSE-214 细胞 100X (接毒 48h)；图 4c:CHSE_214 细胞100X(接毒72h);图4d:CHSE-214细胞100X (接毒72h);从图示结果分析可以证明:IPNV接种单层CHSE-214细胞48h后，细胞开始聚集、圆缩脱落，细胞病变结果如图所示。结果显示CHSE-214细胞随感染IPNV时间的增长，细胞病变越加明显。
【具体实施方式】
[0024]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0025]本发明中使用的传染性胰脏坏死病病毒感染病料由本实验室保存(发表的相关文章:胡晓利，李伟，肇慧君，吴斌.虹鳟鱼传染性胰脏坏死病病毒的分离与鉴定[J].中国动物检疫，2012，29 (3):27-30)。M199培养基为美国Gibco公司产品；胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司。PCR试剂 盒、蛋白酶K均购自大连TaKaRa有限公司；pMD18_T载体，宿主菌DH5 a、PCR试剂盒、分子量标准DL-2000、DNA快速纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均为TaKaRa公司产品；IPNV ELISA检测试剂盒购自TEST-LINE Ltd ;氨苄青霉素(Amp)为上海生工公司产品；其余试剂均为分析纯产品。CHSE-214细胞购自ATCC。
[0026]根据IPNV-DL的保守基因N基因序列，设计特异性引物，由宝生物公司合成，序列如表1，利用该特异性引物分别扩增224bp大小的片段。引物终浓度均为20i!mOl/L。
[0027]表1检测IPNV-DL的引物序列
[0028]
【权利要求】
1.一种传染性胰脏坏死病病毒标准样品的制备方法，其特征在于，制备步骤包括: a.感染IPNV-DL病毒的组织病料稀释液接种CHSE-214细胞获得病毒增殖液；步骤包括:将已长满单层的CHSE-214细胞用0.05%胰酶消化，悬浮于含10%胎牛血清的M199培养基中，以I~2X IO6个细胞/细胞瓶分装，待细胞长至培养单层80%面积时，倒掉含10%胎牛血清的M199培养基，加入200 μ L步骤a中的感染IPNV-DL病毒的组织病料稀释液的上清液，20°C感作lh，再用无血清的M199培养基清洗两次，覆盖含1%甲基纤维素、2%血清的M199维持液；20°C低温培养箱继续培养，直至细胞病变达到80%时，反复冻融3次后，40C，lOOOOrpm，离心lOmin，得上清液即为IPNV-DL病毒增殖液； b.将步骤a中获得的病毒增殖液低温真空冷冻干燥制备成混合冻干粉；所述低温真空冷冻干燥条件:将IPNV-DL病毒增殖液经6000rpm，离心IOmin去除细胞碎片后，保留上清液，在无菌操作条件下按1:1体积比和冻干保护剂混合，在_40°C冰柜中预冻24h，在设定的冻干条件进行冻干，其中所述的设定的冻干条件为冷肼温度为_80°C，真空度30mton.，冻干时间24h ;所述冻干保护剂为:按蔗糖:去离子水的重量体积比为5%，脱脂奶粉:去离子水的重量体积比20%配制，108°C高压灭菌15min ； c.检测步骤b中获得的混合冻干粉样品均匀性、稳定性后定值并分装。
2.根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，所述步骤a中感染IPNV-DL病毒的组织病料稀释液为:用M199细胞培养液将感染IPNV-DL病毒的组织病料样品匀浆、依次稀释成1:10、1:100及1:1000三个稀释度。
3.根据权利要求1`所述的标准样品的制备方法，其特征在于，所述步骤a中获得病毒增殖液 TCID5tl 为 10_8…5/0.ImL0
4.由权利要求1所述的方法制备的传染性胰脏坏死病病毒标准样品。
【文档编号】C12N7/00GK103614342SQ201310554941
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】吴斌, 肇慧君, 胡强, 宋立奇 申请人:吴斌, 肇慧君, 胡强, 宋立奇