嗜酸乳杆菌的复合发酵菌剂以及制备该菌液的方法
【专利摘要】本发明嗜酸乳杆菌的复合发酵菌剂以及制备该菌液的方法属于生物菌在饲料中应用的【技术领域】，涉及一株优选的LAg12-7嗜酸乳杆菌，特别涉及含有该菌的复合发酵菌剂以及制备该菌液的方法，以及该复合发酵菌剂用于将食品工业废弃物、饲料原料和辅料发酵后，制备成反刍动物微生态功能饲料的方法。LAg12-7嗜酸乳杆菌的产酸、耐酸和抑菌性能好，并能与枯草芽孢杆菌和啤酒酵母菌有很好的配伍，使发酵饲料中pH值迅速降至4.0以下，快速抑制有害微生物，并使有益菌始终处于优势状态，可使发酵饲料能长期保质。本发明制备的反刍动物微生态功能饲料的工艺简单易行、生产成本低、饲喂方便、保质期长，而且可提高日粮纤维素等的消化率、经济效益好。
【专利说明】嗜酸乳杆菌的复合发酵菌剂以及制备该菌液的方法
【技术领域】
[0001](本申请是分案申请，原案为中国专利申请201210399518.8)本发明属于微生物有益菌在饲料中应用的【技术领域】，涉及一株优选的嗜酸乳杆菌，特别涉及含有该嗜酸乳杆菌的复合发酵菌剂，以及该复合发酵菌剂用于将食品工业废弃物作为饲料原料与辅料混合后发酵，制备成反刍动物微生态功能饲料的方法。
【背景技术】
[0002]微生态功能饲料是由多种有益微生物对有关饲料原料进行发酵处理后的饲料，其中的微生物和代谢产物与相关动物体内的自然微生态体系相吻合和营养互补。利用微生物发酵技术生产的微生态功能饲料，对于开发利用饲料资源，提高饲料利用率，调节动物体内微生态平均，替代抗生素，防治某些疾病，具有积极意义。
[0003]用于生产发酵饲料的原料十分广泛，从早期的石油、甲醇、乙醇等碳氢化合物到目前的食品加工副产物、废弃物、农作物秸杆等。其中对利用饼柏作为原料生产发酵蛋白饲料的研究报道较多，该类发酵的目的是去除其中的抗营养因子和毒素，以提高加工副产物在配合饲料中的用量比例。而对食品加工废弃物，如玉米黄浆水、玉米喷浆纤维、酱糟、木薯渣等，因其酸碱性和含盐量不适合现有发酵菌的发酵工作，而未用发酵菌将玉米黄浆水、玉米喷浆纤维、酱糟、木薯渣等进行发酵制造饲料。
[0004]下面是现在玉米黄浆水、玉米喷浆纤维、酱糟、木薯渣在饲料应用方面存在的问题:
[0005]玉米黄浆水是指在玉米淀粉生产过程中分离出来的悬浊液，其中BOD值高达
1.5mg/g,富含有机物质，一股工厂均排放入江、河、湖泊，造成了严重的污染。据测定，玉米黄浆水的水分含量达90.01% (许剑秋，2002)，将玉米黄浆水浓缩成含水60%左右的浓缩液称为玉米黄浆液，其粗蛋白 可达含量10~15%。
[0006]喷浆玉米纤维是玉米黄浆水与玉米皮的混合干燥物，水分含量10%左右，粗蛋白22~24%，粗纤维11~13%左右。对于利用喷浆玉米纤维生产发酵饲料的尚未见文献报道。
[0007]酱糟是指用大豆、大米、麸皮等酿造酱油以后剩下的糟渣，含干物质41.47%，粗蛋白质12.72%，粗脂肪5.31%，粗纤维21.43%，无氮浸出物0.62%，灰分4.12%，钙0.08%，磷0.04% (苏玉贤，2001)。目前多数企业将酱糟烘干以后制成酱糟粉作饲料利用，但干燥过程能耗高。
[0008]木薯渣是用木薯生产淀粉或酒精后的废料，新鲜木薯渣的水分含量85.0%以上，烘干后的木薯渣的水分含量10.0~12.0%，蛋白含量4.0%左右，粗纤维含量12%.0，适口性较差，直接用作饲料的价值较低。
[0009]国内外对利用食品工业废弃物生产发酵饲料已有一些报道。许剑秋2002年报道了利用白地霉发酵玉米黄浆水生产饲料蛋白粉，但需要压滤后再烘干，设备投资大，该技术尚处于实验室研究阶段(许剑秋，玉米淀粉废水生产饲料蛋白，粮食与饲料工业2002年第4期)。闻琦涛等(2000年)利用光合菌(PSB)发酵玉米黄浆水生产PSB菌泥(闰琦涛等，玉米淀粉黄浆水PSB法资源化开发的应用前景，吉林粮食高等专科学校学报，2000年第4期)，该技术需要将发酵液进行菌液分离，使液体达标排放，但同样也是设备投资较大。
【发明内容】
[0010]本发明要解决的技术问题是提供一种具有优良性能的嗜酸乳杆菌，以及适合以玉米黄浆液、玉米喷浆纤维、酱糟和木薯渣为主要原料的复合发酵菌剂和可以替代反刍动物精料的微生态功能饲料及其制备方法。该饲料可以降低反刍动物饲料成本，增加反刍动物对粗饲料的采食量和日粮粗纤维的消化率，提高反刍动物生产性能和非特异性免疫功能，降低反刍动物发病率，增加反刍动物养殖经济效益。
[0011]本发明的第一个目的是提供一种耐酸耐胆盐的嗜酸乳杆菌即LAgl2-7嗜酸乳杆菌；
[0012]本发明的第二个目的是提供含LAgl2_7嗜酸乳杆菌的复合发酵菌剂；
[0013]本发明的第三个目的是提供将复合发酵菌剂制备成复合发酵菌液的方法；
[0014]本发明的第四个目的是提供含复合发酵菌液的反刍动物微生态功能饲料，根据反刍动物的营养需要和日粮配制特点，以食品工业废弃物为主要原料，添加适当发酵辅料，经LAgl2-7嗜酸乳杆菌和其它多种微生物发酵后，成为可以直接替代反刍动物精料的反刍动物微生态功能饲料；
[0015]本发明的第五个目的是提供含复合发酵菌液的反刍动物微生态功能饲料制备方 法。
[0016]本发明指的LAgl2_7菌株，或LAgl2_7嗜酸乳杆菌是:LAgl2_7Lactobacillusacidophilus LAgl2-7。本发明所提供的LAgl2_7菌株分离自牦牛胃肠道粘膜，经鉴定为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。 LAgl2_7Lactobacillus acidophilus LAg12-7嗜酸乳杆菌保藏日期:2012年8日3日，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址:中国、武汉、武汉大学(电话027-68754052)，存活检测日期2012年8月7日:保藏号为:CCTCCNO:M2012305 ;该嗜酸乳杆菌具有以下特性:
[0017](I)该菌接种于MAS液体培养基，在37°C条件下培养22小时达到最高生长浓度，0D600 值为 2.86(见图1)；
[0018](2)该菌接种于MRS液体培养基，在37°C条件下培养36小时以后，培养液的pH值低于3.50(见图2)；
[0019](3)该菌在ρΗ2.0条件下处理2小时之后的存活率为69.32% (见表1)；
[0020](4)该菌在重量比为0.4%浓度的胆盐条件处理2小时之后，菌的存活率为53.60% (见表 2)；
[0021](5)该菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的抑菌圈分别是:
12.14 ~17.30mm (见表 3)。
[0022]本发明所提供含LAgl2_7嗜酸乳杆菌的反刍动物微生态功能饲料至少具有以下一种功能:
[0023](I)增强反刍动物对粗饲料的采食量和对日粮纤维的消化率:对酒糟的采食量提高4.46%~13.24% (见表6)，粗纤维消化率提高9.73%~19.02% (见表8)；[0024](2)提高反刍动物生产性能和经济效益:日增重提高7.89%~8.77% (见表7)，毛利润增加42.94%~76.69% (见表11)；
[0025](3)具有调节反刍动物瘤胃微生物平衡的功能，增加瘤胃纤维分解菌的数量:对黄色瘤胃球菌等、白色瘤胃球菌、嗜酸乳酸杆菌和牛链球菌的数量极显著提高(见表9)；
[0026](4)保护反刍动物机体抗氧化系统、提高非特异性免疫功能，增强抗病力:对血清中总蛋白、白蛋白和三种免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM)各指标的浓度明显提高，对总抗氧化能力和超氧化物歧化酶的活性明显提高(见表10)。
[0027]本发明涉及菌、菌剂、活化方法、饲料配方和饲料制作方法的技术内容如下:
[0028]l、LAgl2_7嗜酸乳杆菌的获得
[0029]采用常规乳酸菌的分离、筛选和鉴定方法，从牦牛胃肠道粘膜中分离得到108株乳酸菌，通过生理生化性能测定，产酸、耐酸耐盐实验等，从中筛选出一株性能优良的嗜酸乳杆菌，命名为LAgl2-7嗜酸乳杆菌，经冷冻干燥制作成LAgl2-7嗜酸乳杆菌冻干粉。该菌由中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，其编号为CCTCC M2012305，该菌冻干粉的活菌数可达200亿/克。
[0030]2、复合发酵菌剂的配方和复合发酵菌液的制作
[0031]复合发酵菌剂组份按重量比组成为:LAgl2_7嗜酸乳杆菌冻干粉30.0~60.0 %、枯草芽孢杆菌冻干粉20.0~50.0%、啤酒酵母菌冻干粉10.0~30.0%。
[0032]上述LAgl2_7嗜酸乳杆菌同于由中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，其编号为CCTCC M2012305的LAgl2-7嗜酸乳杆菌，其冰干粉活菌数为200亿/克；枯草芽孢杆菌冻干粉购自华辰兴业(成都)科技有限公司，其活菌数为200亿/克；啤酒酵母菌冻干粉购自安琪酵母股份有限公司，其活菌数为200亿/克。
[0033]使用复合发酵菌剂对底物进行发酵前，需将复合发酵菌剂先活化制成合发酵菌液。制备合发酵菌液的方法是:按重量比称取5.0~15.0 %的红糖加入80.0~90.0 %的清洁水，待红糖溶化后，加入复合发酵菌剂0.3~1.0 %、维生素C0.1~0.4 %、尿素2.0~5.0%和磷酸二氢钾0.1~0.5%，搅拌均匀；保持温度和时间为:32°C条件下保温2~3天，保温期间每天搅拌一次，溶液PH值即能降到4.0以下，获得活化好的复合发酵菌液。
[0034]3、反刍动物微生态功能饲料的组成配方和制作方法
[0035]根据反刍动物营养需要和饲喂特点，先用重量比为75.0~85.0 %的发酵主料与
10.0~20.0 %的发酵辅料进行混合，再加入2.0~6.0 %的复合发酵菌液进行充分混合制成发酵原料，然后将发酵原料装入发酵塑料袋中，密封发酵塑料袋使发酵原料在发酵塑料袋中进行发酵。发酵条件为:在环境温度15~30°C条件下发酵2~3天，获得成品反刍动物微生态功能饲料；或在环境温度6~15°C条件下发酵5~7天，获得成品反刍动物微生态功能饲料。
[0036]以上发酵主料的组成及重量比为:按重量比称取玉米黄浆液20.0~35.0%、喷浆玉米纤维25.0~45.0 %、酱糟20.0~40.0 %和木薯渣5.0~15.0 %直接混合。
[0037]发酵辅料的组成及重量比为:按重量比称取麦麸50.0~65.0%，啤酒酵母粉20.0~35.0 %，碳酸钙4.0~8.0 %、碳酸氢钠4.0~8.0 %、氯化镁1.0~4.0 %直接混合。
[0038]复合发酵菌液的组成及重量比为:红糖5.0~15.0%、清洁水80.0~90.0%、复合发酵菌剂0.3~1.0%、维生素C0.1~0.4%、尿素2.0~5.0%和磷酸二氢钾0.1~
0.5%。
[0039]复合发酵菌液的制备方法:按重量比称取5.0~15.0%的红糖加入80.0~
90.0 %的清洁水，待红糖溶化后，加入复合发酵菌剂0.3~1.0 %、维生素C0.1~0.4 %、尿素2.0~5.0%和磷酸二氢钾0.1~0.5%，搅拌均匀；保持温度和时间为:32°C条件下保温2~3天，保温期间每天搅拌一次，溶液pH值即能降到4.0以下，获得活化好的复合发酵菌液。
[0040]本发明中:
[0041]玉米黄浆液的含水量为58~60% ;
[0042]喷浆玉米纤维的含水量为10~12% ；
[0043]酱糟的含水量为10~12% ；
[0044]木薯渣的含水量为10~12%。
[0045]上述发酵原料:玉米黄浆液为玉米黄浆水浓缩为含水58~60%的浓缩液，购自鲁州生物科技(四川)有限公司；喷浆玉米纤维是玉米黄浆水与玉米皮的混合干燥物，水分含量10~12%，购自鲁州生物科技(四川)有限公司；酱糟是生产酱油的余渣经干燥而成，水份含量10~12%，购自成都国酿食品股份有限公司；木薯渣的水份含量为10~12%，购自四川金盛源生物化工有限公司；啤酒酵母粉是在生产啤酒过程中，啤酒发酵液过滤后的余渣经干燥而成，水份含量为10%，购自金威啤酒(成都)有限公司。
[0046]本发明的优点:针对目前国`内对食品加工废弃物玉米黄浆液、喷浆玉米纤维、酱糟以及木薯渣开发饲料产品的方法单一、设备复杂、能耗较高的现状，本发明综合运用微生物发酵技术和动物营养原理，以食品工业废弃物一玉米黄浆液、玉米喷浆纤维、酱糟和木薯渣为发酵主料，再根据反刍动物的营养需要特点添加发酵辅料，再加入活化后的复合发酵菌液(含LAgl2_7嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌和啤酒酵母菌)后，直接装入发酵塑料袋中进行固态发酵。本发明具有以下优点:
[0047]1、优良的LAgl2_7嗜酸乳杆菌株
[0048]本发明从牦牛胃肠道粘膜中分离的108株乳酸菌中，经反复筛选得到一株性能优良的嗜酸乳杆菌，命名为LAgl2-7嗜酸乳杆菌(微生物保藏编号:CCTCC M2012305)。该菌接种于MRS液体培养基中，在37°C培养22小时即达到最高生长浓度，0D600值为2.86，在MRS液体培养基中37°C条件下培养36小时，培养液的pH值即低于3.50 ;在pH2.0处理2小时之后的存活率为69.32% ;在0.7%%胆盐浓度处理2小时之后的存活率为53.60% ;对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌均有较为明显的抑制作用，经冷冻干燥制作成LAgl2-7嗜酸乳杆菌冻干粉，冻干粉的活菌数为200亿/克。
[0049]由于LAgl2_7嗜酸乳杆菌的产酸、耐酸和抑菌性能好，并能与枯草芽孢杆菌和啤酒酵母菌有很好的配伍，使发酵饲料中PH值在24小时以内迅速降至4.0以下，快速抑制有害微生物的生长，并使有益菌始终处于优势状态，可使发酵饲料能长期保质。
[0050]2、制备反刍动物微生态功能饲料的工艺简单易行
[0051]本发酵饲料改变一股固态发酵模式，通过菌种组合，将配制好的发酵原料放入发酵塑料袋中，进行好氧与厌氧相结合的立体式节能发酵:前期主要由好氧菌(酵母菌)发酵，消耗掉发酵原料中的氧气，后期主要由厌氧菌(嗜酸乳杆菌)发酵，使发酵饲料中pH值24小时以内迅速降低至4.0以下，快速抑制有害微生物的生长，同时枯草芽孢杆菌繁殖产生大量纤维素酶、蛋白酶等消化酶。经7~20天发酵即得成品反刍动物微生态功能饲料。可装载质量40kg发酵原料的塑料袋即是发酵容器，也是成品包装、贮藏袋和运输袋，无须再包装、无须再干燥，直接运送到用户。
[0052]3、反刍动物微生态功能饲料生产成本低
[0053]本发明以低价的食品工业废弃物为主要原料，同时对弃物原料采用无须烘干的节能发酵工艺，使饲料的生产成本低。由于通过添加适当发酵辅料和和含LAgl2-7嗜酸乳杆菌的复合发酵菌剂进行发酵后，成为具有较高营养价值的反刍动物微生态功能饲料。在反刍动物精料中添加20~60%的本发明微生态功能饲料，在提高反刍动物生产性能的同时，可降低反刍动物饲料成本4%左右。
[0054]4、反刍动物微生态功能饲料使用方便
[0055]本发明根据反刍动物的营养需要和使用特点设计，使发酵后的微生态功能饲料的营养指标基本达到反刍动物精料的营养指标，用户在使用时可直接以20~60%的重量比替代反刍动物精料，无须改变或调整原有反刍动物精料配方，使用方便。
[0056]5、反刍动物微生态功能饲料具有多种功能
[0057]本发明的功能饲料含有多种具有活性的有益菌及其具有生物活性的代谢产物，具有增强反刍动物对粗饲料的采食量和对日粮纤维的消化率、提高生产性能和经济效益、增加瘤胃纤维分解菌的数量、保护机体抗氧化系统、提高非特异性免疫功能、增强抗病力等多种功能。
[0058]6、反刍动物微生态功能饲料保质期长
[0059]本发明的反刍动物微生态功能饲料在环境温度30°C~40°C条件下保质70~90天；或在环境温度O~30°C条件下保质150~180天。而现有含嗜酸乳杆菌发酵的饲料在环境温度30°C~40°C条件下保质15~20天；或在环境温度O~30°C条件下保质30~40天。
[0060]图1是LAgl2_7嗜酸乳杆菌的生长曲线；
[0061]图2是LAgl2_7嗜酸乳杆菌的产酸能力图。
具体实施例
[0062]实施例1、乳酸菌的筛选及性能测定
[0063]1.1、筛选牦牛胃肠乳酸菌获得LAgl2_7嗜酸乳杆菌
[0064]MRS培养基:蛋白胨10.00g、酵母膏5.00g、牛肉膏10.00g、葡萄糖20.00g、磷酸氢二钾2.00g、柠檬酸三氨1.0Og,乙酸钠5.00g、硫酸镁0.80g、硫酸锰0.25g、吐温801ml，用蒸懼水定容至1000ml, pH6.2~6.4,115°C灭菌30min。
[0065]采用常规微生物学方法，从牦牛胃肠道粘膜中分离得到108株乳酸菌，通过产酸、耐酸耐盐实验等，从中筛选出一株性能优良的菌株。该菌株经过生理生化鉴定及16SrDNA分子鉴定确定该菌株为嗜酸乳杆菌，命名为嗜酸乳杆菌LAgl2-7，菌株经冷冻干燥制作成冻干粉，冻干粉的活菌数为200亿/克。该菌由中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，其编号为CCTCC M2012305。
[0066]1.2、LAg12-7嗜酸乳杆菌生长试验[0067]将嗜酸乳杆菌LAgl2_7转入MRS液体培养基中37°C活化15~18小。将活化好的菌株以2% (V/V)的接种量转入MRS液体培养基中厌氧培养，，每隔一定时间取样测定0D600值，以未接种的培养基作为空白对照。结果可见前20小时LAgl2-7嗜酸乳杆菌繁殖迅速，0D600值持续上升；从20~48小时，菌体密度基本趋于平衡，0D600值稳定在2.86左右，处于生长稳定期，见图1。
[0068]1.3、LAg12-7嗜酸乳杆菌产酸试验
[0069]将LAgl2_7嗜酸乳杆菌活化后，接种到MRS液体培养基，在37°C条件下培养，每隔一定时间取样测定pH值，以未接种的MRS液体培养基的pH为初始pH。结果见图2，可见培养36小时以后，LAg12-7嗜酸乳杆菌培养液的pH值低于3.50。[0070]LAg12-7嗜酸乳杆菌活化后，接种MRS液体培养基，在37°C条件下培养，培养一定时间后测定发酵液PH，以未接种的MRS液体培养基的pH为初始pH。结果表明，该菌种培养后PH快速下降，培养到36h以后pH下降趋势趋缓，培养到60h时pH达到3.45.可见培养36小时以后，LAg12-7嗜酸乳杆菌培养液的pH值低于3.50，见图2。
[0071]1.4、LAg12-7嗜酸乳杆菌耐酸试验
[0072]将菌种接种在MRS液体培养基上活化2次，以2 % (V/V)的接种量接种到MRS液体培养基中，在37°C条件下培养24h小时，8000rpm/min离心10分钟，收集菌体，将菌体用pbs (pH6.0)缓冲液洗漆I次,重新悬浮于pbs (pH6.0)缓冲液中。将悬浮液平均分成5分，再次离心收集菌体。将得到的菌体分别悬浮于PH2.0,3.0,4.0、5.0和6.0的pbs缓冲液中，所得到的5份不同pH的pbs菌液，在室温下放置2小时，进行活菌计数，以pH6.0条件下的活菌数为100%，计算其存活率。
[0073]LAg12-7嗜酸乳杆菌耐酸试验结果见表1，表明LAgl2_7嗜酸乳杆菌在pH2.0条件下放置2小时后的存活率为69.32%。
[0074]表lLAgl2_7嗜酸乳杆菌在不同pH值下的存活率 (单位:％ )
[0075]
【权利要求】
1.嗜酸乳杆菌的复合发酵菌剂，其特征在于:该复合发酵菌剂的组成和重量比为:LAg12-7嗜酸乳杆菌冻干粉30.0~60.0%、枯草芽孢杆菌冻干粉20.0~50.0%、啤酒酵母菌冻干粉10.0~30.0% ;所述LAgl2-7嗜酸乳杆菌由中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)保藏，其保藏编号为CCTCC M 2012305。
2.将权利要求1所述复合发酵菌剂制备复合发酵菌液的方法:按重量比称取5.0~.15.0%的红糖加入80.0~90.0%的清洁水，待红糖溶化后，加入复合发酵菌剂0.3~1.0%、维生素C 0.1~0.4 %、尿素2.0~5.0%和磷酸二氢钾0.1~0.5%，搅拌均匀；保持温度和时间为:32°C条件下保温2~3天，保温期间每天搅拌一次，溶液pH值即能降到4.0以下，获得活化好的复合发酵菌液。
【文档编号】C12N1/20GK103881944SQ201310558517
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年10月19日 优先权日:2012年10月19日
【发明者】郭春华, 彭忠利, 罗璠, 柏雪, 王永玲 申请人:西南民族大学, 四川新通达生物饲料科技有限公司