一种高效制备cd44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞的方法
【专利摘要】本发明具体公开了一种高效制备CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞（IPSC）的方法。本发明首先利用TSA对小鼠成纤维细胞（MEF）进行预处理，然后再对MEF进行诱导重编程，IPSC的效率可以随着TSA的浓度升高而被提高。在挑取克隆前，将诱导后的MEF、未完全重编程、IPSC等细胞混合物，传代接种到包被有基质胶或基质膜的培养板上，IPSC的细胞比例可以提高100倍，克隆挑取的成功率提高了13.84%，增加了277.8倍。为提高IPSC的效率提供了新思路和新方法。
【专利说明】—种高效制备CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于干细胞或诱导干细胞【技术领域】，具体涉及一种高效制备CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞的方法，尤其是一种利用TSA对供体细胞进行预处理，并且通过传代选择克隆从而提高诱导重编程效率和克隆培养成功率的方法。
【背景技术】
[0002]诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, IPSCs)可以实现体细胞到干细胞状态的转化，为再生医学和细胞治疗提供了更为丰富的研究资源和干细胞来源；IPSC细胞不仅可以极大地促进疾病模型的制作，而且为极大地推动着病人特异性细胞治疗和药物筛选技术的发展。基因缺陷性遗传疾病，如地中海贫血(Thalassemia)、苯丙酮尿症phenylketonuria, PKU)等单基因缺陷遗传病，主要通过基因治疗的方式，即将正常的基因导入有缺陷基因的患者细胞内，对细胞的缺陷基因进行遗传编辑，恢复缺失或者突变的基因，纠正致病基因，从根本上消除病患。
[0003]透明质酸受体CD44分子是细胞表面的跨膜糖蛋白，是一类重要的粘附分子，参与多种细胞生理功能，例如生长、分化、迁移、感染等。CD44与肿瘤转移密切相关。在临床医学研究中，CD44分子常常作为肿瘤干细胞的一个分子标志，用于分离前列腺癌、胰腺癌、结肠癌干细胞。CD44与肿瘤转移之间的关系十分复杂，可能影响了肿瘤细胞的粘附、运动和胞外基质的降解等过程。例如，CD44分子在结肠癌干细胞的成瘤、致癌、转移等方面具有重要的作用，共培养体系是基于transwell的培养体系，常用来研究某一类型细胞的分泌产物对另外一种细胞产生影响。在MSC与胶质瘤细胞共培养时，干细胞常常表现出对肿瘤细胞生长的抑制作用。因此，⑶44v mIPSC细胞的制作，为研`究⑶44分子对肿瘤迁移的影响，以及探索结肠癌等干细胞治疗策略提供了良好的细胞材料来源。另外，临床上CD44有可能成为新的诊断指标和治疗靶点，CD44分子表达水平与胰腺癌的耐药特性有很大的关系，特异性⑶44 siRNA可显著抑制K562/A02细胞CD44基因的表达，抑制细胞增殖，诱导其凋亡，并有效逆转K562/A02细胞的多药耐药性。⑶44+mIPSC非常类似于肿瘤生长、增殖模式，将为探索研究新型肿瘤抑制药物提供药物筛选的细胞模型。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是为了满足新型肿瘤抑制药物研究对细胞模型的需要，提供一种高效制备CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞的方法。
[0005]本发明的目的通过以下技术方案予以实现:
一种高效制备CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞的方法，包括如下步骤:
51.分离纯化获得CD44基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞；
52.将⑶44基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞加入含有5~IOOnM曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)的培养基中，培养 24h ；
53.诱导CD44基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞重编程，获得CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞克隆。
[0006]为了描述方便，CD44基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞用CD44+MEF来表示；CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞用CD44—7 mIPSC来表示。
[0007]有报道显示TSA能够提高克隆胚胎的发育效率，但是不同研究中所使用的TSA浓度以及TSA处理时间不同，示认为在体细胞克隆中使用TSA时，较高的TSA浓度可能会导致在猪等动物中出现高致死率，造成胚胎异常发育。本文选用了 3个浓度的TSAji⑶44-/-MEF进行了处理，处理24h后，细胞无明显的形态变化，增殖速度也没有明显的改变。虽然不能够显著提高诱导重编程的效率，但是，随着TSA浓度的增加，可以诱导重编程的细胞比例也随之增加。提示，TSA有助于诱导重编程效率的提高，但是，TSA对重编程的贡献可能还只能局限于卵母细胞介导的细胞核重编程。
[0008]优选地，S2所述TSA在培养基中的浓度为ΙΟΟηΜ。
[0009]因为上述步骤S3获得CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞克隆中包括诱导后的MEF、未完全重编程、IPSC等细胞混合物，所以，在挑选克隆过程中，经常会有一些不完全重编程的克隆被挑取，极大地影响克隆培养的工作效率。为了提高克隆培养的质量，通常在诱导重编程后，挑取大量的克隆进行培养，在传代过程中根据形态学对优良的(完全重编程)IPSC进行进一步的培养、鉴定。本文将初次诱导出来的IPSC进行传代，接种在无饲养层的培养平板上进行培养，发现IPSC克隆有着明显的差异。由于无乱杂的体细胞的干扰，通过这种方式可以明显地挑取到轮廓清晰、细胞致密、形态完好的IPSC克隆。传代后，IPSC培养的成功率可以提高到~15%，不仅提高了 IPSC克隆的培养质量，而且极大地减少了劳动强度。
[0010]优选地，S3获得的⑶44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞克隆能通过传代培养来提高阳性克隆的挑取成功率；所述传代培养为:将S3诱导获得的CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞克隆进行消化、传代一次，接种到基质胶或基质膜包被的培养板上，待克隆长出后，挑选圆形或椭圆形、边缘清晰、凸起良好的克隆进行培养。优选地，所述基质胶或基质膜为BD metrigel基质胶或基质膜；当然，基质胶或基质膜也可以是本领域细胞培养中常规使用的其它类型的基质胶或基质膜。
[0011]更优选地，所述用传代方法提高诱导细胞重编程克隆挑取成功率的方法，包括如下步骤:
51.诱导13天的细胞,经过Accutase消化处理后,继续接种在预先铺有BDmetrigel的培养板上，进行扩大培养；待克隆重新长出时，挑取克隆；
52.挑取克隆时，细胞用PBS洗I次后，加入6mLPBS放在热台上；在体视镜下，使用口吸针，将克隆转移到0.2mL离心管中；每管加入0.05%胰酶10 μ L，消化2min后，加入10 μ L血清，吹散；接种到铺有饲养层细胞的明胶包被过的96孔板中，在KSR培养基中培养；12h后换液。
[0012]具体地，SI所述分离纯化获得⑶44基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞包括如下步骤:
511.制作⑶44基因缺陷孕鼠；
512.取13.5天的孕鼠，处死后，分离纯化胚胎；从胚胎中分离获得成纤维细胞。
[0013]具体地，S3所述诱导⑶44基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞重编程包括如下步骤: S31.包装携带有0ct4、Klf4、Sox2 3种重编程因子的逆转录病毒；S32.逆转录病毒感染CD44基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞；在体外培养10-15天，即可获得CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞克隆。
[0014]本发明的有益效果是:
1、利用CD44基因缺陷型细胞进行诱导重编程，不仅可以为研究癌症发生提供新的细胞材料，并且可以为基因缺陷疾病的治疗提供新的策略，为探究调控癌症发生奠定基础。
[0015]2、用TSA对小鼠胚胎成纤维细胞进行预处理，随着TSA浓度的增加，可以诱导重编程的细胞比例也随之增加。其中，5nM、50nM、IOOnM处理组的AP阳性细胞的比例分别为(1.50 ± 0.042)%, (1.83 ± 0.02942) %、(2.007 ± 0.041)%。相比于对照组，TSA-1OOnM 处理组可以将诱导细胞重编程高效率提高0.074%
3、传代后，AP阳性细胞的比例已经从~1%上升到~80%，提高了 100倍，有效地保证了克隆挑取的数量；IPSC培养的成功率可以提高到~15%，提高200多倍；不仅提高了 IPSC克隆的培养质量，而且极大地减少了劳动强度。
[0016]说明书附图
图1.本发明的实验流程示意图。
[0017]图2.⑶44+mIPSCs诱导结果及克隆培养；A、B攻毒24h后的明场、荧光照片；C攻毒第7天的⑶44-/-MEF聚集成一片；D、E攻毒第14天的⑶44-/-MEF，已经有明显隆起的克隆出现；F从DE挑取单克隆到96-feeder cell孔板的生长状况；G、H攻毒第14天的⑶44-/-MEF传代到IOcm-BD metrigel上的培养第二天的生长状况；1从GH (IOcm-BDmetrigel)挑取单克隆到96-feeder cell孔板的生长状况。
[0018]图3.CD44+mIPSCs 的 AP 染色结果。
[0019]图4.CD44+miPSC 的 ICC 结果(0ct4、Nanog、SSEAl、DAPI )。
[0020]图5.CD44-/-mIPSC 与 CD44-/-MEF 的多能基因表达水平；*# 表示 P〈0.001 ;** 表示 P〈0.01 ;* 代表 Ρ〈0.05。
[0021]图6.畸胎瘤切片HE染色结果；(A)外胚层一上皮组织；(B)中胚层一一骨组织；(C)内胚层----消化道。
[0022]图7.CD44-/-mIPSC_Ell 的核型(oil, 10X10)。
[0023]图8.在IOcm BD metrigel增多的细胞克隆。
[0024]图9.在IOcm BD metrigel增多的AP阳性细胞克隆。
[0025]图10.从IOcm BD metrigel挑取的AP阳性细胞克隆再培养时形成克隆能力比较。
[0026]图11.TSA处理供体细胞的诱导重编程效果；(A)诱导第10天克隆数量；(B)诱导13天后，对AP阳性细胞的细胞流式检测结果。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0028]实施例1 一、材料
CD44基因缺陷小鼠:购自美国Jackson实验室(货号005085)；L-维生素C 二磷酸三钠(货号49752，Sigma)；
Knockout DMEM/F12培养液购自Life Technologies公司；试剂购自sigma公司;抗体购自eBioscience公司;质粒pMXs_0ct4 (O,携带有小鼠0ct4基因序列，genebank:NM_013633)、pMXs-Klf4 (K，携带有小鼠 Klf4 基因序列，genebank:ΝΜ_010637)、pMXs_Sox2(S，携带有小鼠Sox2基因序列，genebank:NM_011443)为中山大学生命科学学院动物遗传
工程实验室保藏。
[0029]二、试验步骤:本实施例的整个流程示意图如图1所示。
[0030]S1.分离纯化得到⑶44基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞(⑶44+MEF细胞)。 [0031]Sll.分离小鼠胚胎:制作⑶44基因缺陷孕鼠，见阴道栓时，算受孕0.5天；取13.5天的孕鼠，在中山大学动物福利与伦理委员会指导下处死，无菌取出胎儿；剥离胎盘组织，用含有抗生素的PBS洗2次；用剪刀、眼科镊子取出头、四肢、尾巴、内脏等，躯干组织剪碎后，转移到15mL离心管中；1600rpm,离心5min,弃上清,收集下层细胞；
S12.分离纯化MEF细胞:将下层细胞用5mL胰酶重悬后，再加入2μ L DNasel，将混合液转移到50mL离心管中；37°C条件下孵育30min ;加7mL含有10%血清的培养液重悬细胞；1600rpm，离心5min，弃上清；沉淀用培养液重悬后，取上层细胞悬液，用40 μ m细胞筛过滤后；计数，按5X IO6个细胞接种到I个IOcm培养皿中，放置37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养。培养24h后换液，大约2天长满即得⑶细胞。
[0032]S2.TSA处理MEF细胞:将步骤S12获得的⑶细胞传代后，将获得的OMflffiF细胞(P 1~P2)接种到24孔板中，每孔大约IO4个细胞；培养12h后，细胞用PBS洗2次；加入含有不同浓度TSA (TSA在培养基中的浓度分别为5nM、50nM、IOOnM)的培养基继续培养24h，然后用PBS洗I次；再进行诱导重编程处理；同时用不经过TSA处理的MEF细胞进行诱导重编程，作为对照。
[0033]S3.诱导⑶44+MEF细胞重编程
S31.逆转录病毒的包装:提取pMXs-0ct4、pMXs-Klf4和pMXs_Sox2质粒，将pMXs-0ct4、pMXs-Klf4、pMXs-Sox2质粒进行无内毒素处理后；将其浓度浓缩到I μ g/μ L ;
将40 μ L lipo2000加入到ImL Opt1-MEM中，轻柔混匀，记作A液；将pMXs_0ct4、pMXs-Klf4、pMXs-Sox2质粒各10 μ g加入到ImL Opt1-ΜΕΜ中，轻柔混匀，记作B液；室温放置5min后；将B液加入A液中，轻柔吹打40下；室温放置30min ；
Plat-E细胞生长到70%覆盖度时，PBS洗2次，加入5mL新鲜培养基；继续培养30min后，将混匀的A+B液滴入培养液中，轻轻混匀；继续培养；收集24h、48h、72h时的培养液，
0.45 μ m滤器过滤后，即为新鲜的病毒液。
[0034]S32.诱导重编程过程:⑶44+MEF细胞达到70%汇合度后，PBS洗2次，加入新鲜的病毒液(含有polybrane,终浓度8 μ g/mL),室温放置30min后,放入培养箱培养；12h后，换液(培养液为10%血清培养基添加终浓度为50 μ g/mL的Vc);继续培养12h后，在进行病毒感染一次；12h后,换液(培养液为一半体积的含有Vc的10%血清培养基,一半体积的干细胞培养基)；之后，使用干细胞培养液培养，每天换液，继续培养到13天。
[0035]S33.1PSCs克隆的挑取
第13天诱导的⑶44+MEF上出现了明显的克隆，即为⑶44+IPSCs ;将这些细胞用PBS洗2次，利用0.25%的胰酶消化后，接种到IOcm包被有BD metrigel的培养板上，继续培养；第3天后，培养班上出现明显的克隆；
移去培养基，PBS洗I次，加入6mL PBS放在热台上；在体视镜下，使用口吸针，将单个克隆分别转移到0.2mL离心管中；每管加入0.05%胰酶10 μ L，消化2min后，加入10 μ L血清，吹散；接种到铺有饲养层细胞的明胶包被过的96孔板中，在KSR培养基中培养；12h后换液。
[0036]S34.CD44+IPSCs克隆的传代培养
克隆需要传代时，用PBS洗2次后，加入消化酶Accutase，2min后，加入KSR培养液吹散，转移到离心管中，2000rpm离心5min ;细胞重新1:5~1:10接种到饲养层细胞上,或者明胶、BD metrigel包被的培养板中。
[0037]S4.CD44+IPSCs 的鉴定 S41.AP染色及AP-1ive染色
AP染色:细胞用PBS洗2次后，4%多聚甲醛溶液固定IOmin ；PBS洗3次，每次5min ;按照说试剂明书配制染色工作液，轻轻加入细胞中，避光室温下孵育30min ;待细胞有颜色变化时，弃掉染色液，用PBS洗2次，每次5min ;拍照观察；
AP-1ive染色:根据试剂盒说明书，用01^1^12稀释500父的贮存液；细胞用DMEM-F12洗2次后，加入AP-1ive染色液，放入培养箱孵育30min ；PBS洗3次后拍照观察。
[0038]S42.细胞免疫荧光实验
吸弃培养板中的培养液，用PBS清洗3次，每次5min ;加入4%的多聚甲醛溶液，室温固定30min ；PBS清洗3次，每次5min ;加入0.5% TritonX-1OO室温孵育30min ；PBS清洗3次，每次5min ;加入1% BSA/PBS室温封闭Ih ;加入稀释的一抗，温室孵育2小时或者4°C过夜；PBS清洗3次，每次5min ;加入稀释的二抗，温室避光孵育Ih ；PBS清洗3次，每次5min ；加入5Pg/mL的DAPI避光染色5分钟；PBS洗2次，每次5min ;荧光显微镜下观察，拍照。
[0039]S43.畸胎瘤的制作及染色
消化CD44+IPSCS，制成单细胞悬液，加入DMEM使细胞密度在5 X IO6个/150μ?左右；把150-200μ?细胞悬液注射到裸鼠后腿内侧皮下；30天后手术法取出畸胎瘤并进行HE染色，
S44.染色质核型分析
将⑶44+IPSCs在体外培养24~48h后，向培养液中加入终浓度为0.05 μ g/mL的秋水仙胺处理1.5h ；PBS洗I次，0.25% Tyrisin-EDTA消化至克隆松散，加入2.5mL的培养液终止消化反应，将克隆充分吹打成单细胞；2000rpm离心5min,弃上清，向细胞中加入IOmL低渗液(0.075M KCl )，用力吹打100次以上，静置30min ;加入3滴_20°C预冷的新鲜配制的固定液(甲醇:冰醋酸，3:1),颠倒混匀后静置5min后,2000rpm离心5min,弃上清；向细胞中加入IOmL固定液，轻柔吹打混匀后静置30min，2000rpm离心5min，去上清，保留ImL上清，轻轻拍打悬起，缓慢加入固定液，边加边振荡，直至满管；如此重复3次；用0.5~lmL左右的固定液将细胞重悬，吹打均匀后滴:1-4滴悬液至清洗干净并-20°C预冷的载玻片上；30°倾角放置载玻片，室温晾干；加一滴Gimesa染液染色10分钟，到显微镜下观察染色体；
S45.定量PCR 鉴定 CD44+IPSCS
细胞用PBS洗2次后，加入TriZol试剂处理2min，提取总mRNA ;使用Olig0 dT引物对mRNA进行反转录后；使用LightCycler 480仪器对基因的表达量进行分析。[0040]三、结果分析:
克隆形态=CDAfAlPSCs在诱导后，细胞由成纤维状变成了圆形、椭圆形、隆起的、边缘清晰的、细胞紧密的克隆，如图2。
[0041]AP染色:诱导得到的⑶44+IPSCs经过AP染色后，克隆具有较高的AP活性，如图3。
[0042]干细胞标志分子表达:诱导得到的⑶44丨IPSCs表达干细胞标志分子0ct4、SSEAl、Nanog 等，如图 4。
[0043]多潜能基因表达水平:诱导得到的CD44+IPSCS表达多潜能基因0ct4、Sox2、Nanog等，与诱导前的CD44+MEF比较，差异极显著，(P<0.01 / P<0.001)如图5。
[0044]畸胎瘤:诱导得到的⑶44+IPSCs在体内可以形成畸胎瘤，并且可以分化形成3胚层的组织，如 图6。
[0045]染色体核型:诱导得到的⑶44+IPSCs具有完整的染色体数目，核型无明显的异常，如图7。
[0046]TSA处理对重编程效率的影响:与未经TSA处理组相比，经过TSA处理的细胞，在诱导第10天时，已经出现了明显的细胞形态变化，细胞变为圆形、聚集明显，并且具有极高的AP活性；在第10天时，出现的细胞聚集的集落数，浓度为50nM的实验组最高，但是3种浓度之间并无显著性差异；在诱导第13天，对细胞进行流式检测，结果如图11，细胞的AP阳性比例随着TSA浓度的增加而提高；100nM处理后，AP阳性细胞比例最高，尽管和未处理组无显著性差异，但是，比未处理组提高了 0.074%。
[0047]传代处理对克隆挑取成功率的影响:诱导的细胞经过传代接种到BD metrigel包被的培养板中进行培养后，克隆的数目明显增多，尤其是圆形、椭圆形、隆起的、边缘清晰的、细胞紧密的克隆数目明显增多，极大便利了多克隆的挑选，如图8 ；AP阳性细胞比例显著提高，如图9 ;对挑选的克隆进行传代培养发现，经过传代处理后，克隆的挑取、培养成功率提高了 200多倍。
[0048]综合以上结果，本专利发展了一种制作和鉴定⑶44v mIPSC的方法，并且使用TSA提高了诱导重编程效率，利用传代的方法提高了克隆的挑取培养成功率，为肿瘤发生机制研究、抗癌药物筛选提供了干细胞材料。
【权利要求】
1.一种高效制备CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤: 51.分离纯化获得CD44基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞； 52.将CD44基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞加入含有5~IOOnM曲古抑菌素A的培养基中，培养24h ； 53.诱导CD44基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞重编程，获得CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞克隆。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S3获得的CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞克隆能通过传代培养来提高阳性克隆的挑取成功率；所述传代培养为:将S3诱导获得的CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞克隆进行消化、传代一次后，接种到基质胶或基质膜包被的培养板上，待克隆长出后，挑选圆形或椭圆形、边缘清晰、凸起良好的克隆进行培养。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述基质胶或基质膜为BDmetrigel基质胶或基质月吴。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S2所述曲古抑菌素A在培养基中的浓度为ΙΟΟηΜ。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，SI所述分离纯化获得CD44基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞包括如下步骤:` 511.制作⑶44基因缺陷孕鼠； 512.取13.5天的孕鼠，处死后，分离纯化胚胎；从胚胎中分离获得成纤维细胞。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，S3所述诱导CD44基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞重编程包括如下步骤: `531.包装携带有0ct4、Klf4、Sox23种重编程因子的逆转录病毒； `532.逆转录病毒感染CD44基因缺陷小鼠胚胎成纤维细胞；在体外培养10-15天，即可获得CD44基因缺陷小鼠诱导多能干细胞克隆。
【文档编号】C12N5/10GK103695469SQ201310558490
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】宋振威, 冀倩倩, 赵海静, 聂宇, 丛佩清, 陈瑶生 申请人:中山大学