血清中甘油三酯的甘油脱氢酶测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种应用甘油脱氢酶测定血清中甘油三酯的方法，属于利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是：甘油脱氢酶及NAD+同在试剂I中，试剂II含有脂蛋白脂肪酶有效成分；其测定方法为：血清先与试剂I于37℃温浴3～5分钟，血清中游离甘油与试剂I反应生成NADH，加入试剂II后于37℃温浴4～7分钟，甘油三酯水解后生成甘油经反应产生NADH，仪器在340nm波长处检测，以试剂I反应产生的NADH为空白，由试剂II反应产生的NADH计算出甘油三酯的含量。本发明检测时不受内源性甘油影响，其使用方法和范围与其它酶法相同，所用工具酶少，受杂酶干扰少，试剂成本低，经济方便易行，是一种准确性更高的甘油三酯检测方法。
【专利说明】血清中甘油三酯的甘油脱氢酶测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪检测血清中甘油三酯的甘油脱氢酶测定方法。【背景技术】
[0002]血清中甘油三脂(TG)的测定方法一般可分为化学法、酶法和色谱法3大类。早期测定方法是以总脂质与胆固醇和磷脂之差估算。比较准确的是二氯甲烷-硅酸-变色酸法(Van Handel-Caslson法)，此法抽提完全、能去除磷脂及甘油干扰、变色酸显色灵敏度高、显色稳定，至今还是美国疾病控制与预防中心(CDC)的内部参考方法。但因操作步骤繁多、技术要求高而不适于临床常规检测工作中应用。色谱法包括核素稀释/气相色谱/质谱等方法(ID/GC/MS)，主要用作参考系统中决定性方法的建立及参考物质的制备与定值，此法费用昂贵，样品处理复杂，难以推广应用，应用高效液相色谱仪测定血清中的甘油三酯，检测成本高，难以在临床推广。
[0003]目前国内几乎所有的临床实验室都用酶法检测血清TG水平，此方法分为一步法和两步法，虽然方法各异，但一般都包括以下几个基本反应步骤:用最合适的脂蛋白脂肪酶(LPL)水解TG生成甘油和脂肪酸；水解后的甘油和三磷酸腺苷(ATP)在甘油激酶(GK)和甘油磷酸氧化酶(GPO)的催化下生成H2O2，在过氧化物酶(POD)的催化下，H2O2,4-氨基安替比林(4-AAP)和2，4-二氯酚形成有色染料(常为醌亚胺类)，这些物质的生成量与样本中的甘油三酯含量成正比。本发明采用甘油脱氢酶为工具酶，是将试剂分成两部分，仅以脂蛋白脂肪酶为第二试剂，由于试剂组成成分加入顺序不同，对甘油三酯测定结果产生不同效果，具有消除游离甘油干扰的特性，本法应用工具酶少，降低杂酶干扰和试剂成本等优点，具体反应步骤如下:
[0004]第一步反应:
[0005]
【权利要求】
1.一种血清中甘油三酯的甘油脱氢酶测定方法，其特征在于甘油脱氢酶及NAD+同在试剂I中，试剂II仅含有脂蛋白脂肪酶有效成分；其测定方法为:血清先与试剂I于37°c温浴3~5分钟，血清中游离甘油与试剂I的反应生成NADH，加入试剂II后于37°C温浴4~7分钟，甘油三酯水解后经反应也生成NADH，仪器在334~340nm波长处检测，以试剂I反应产生的NADH为空白，由试剂II反应产生的NADH计算出甘油三酯的含量，计算公式为:
ODtg = OD2-OD1X [ (SV+RJi) / (SY+R1Y,+R2Y2)] 甘油三酯浓度=FXODtg 其中ODtc是甘油三酯产生的吸光度，OD1是样品加入试剂I反应后测得的吸光度，OD2是样品加入试剂II反应后测得的吸光度，SV是血清的体积，R1V1是试剂I的体积，R2V2是试剂II的体积，F是校正因数。
2.根据权利要求1所述的血清中甘油三酯的甘油脱氢酶测定方法，其特征在于试剂I中含有甘油脱氢酶及NAD+。
3.根据权利要求1所述的血清中甘油三酯的甘油脱氢酶测定方法，其特征在于试剂I中每升碳酸盐缓冲液溶解碳酸钾100~300mmol,碳酸氢钠100~300mmol, NAD+5~15mmol，甘油脱氢酶 40000 ~50000U, Proclin-300 防腐剂 100 μ I ~300 μ I ;试剂 II 中每升碳酸盐缓冲液溶解碳酸钾100~300mmol，碳酸氢钠100~300mmol，溶解脂蛋白脂肪酶1800 ~2100U，Triton X-100 0.08g ~0.16g, Proclin-300 防腐剂 100 μ I ~300 μ I。
4.根据权利要求3所述的血清中甘油三酯的甘油脱氢酶测定方法，其特征在于试剂I和试剂II中碳酸盐缓冲 液的PH值为10.5~11.5。
5.根据权利要求3所述的血清中甘油三酯的甘油脱氢酶测定方法，其特征在于测定的体积比为:样品:试剂1:试剂II = I: 70~80: 20~30。
【文档编号】C12Q1/32GK103602718SQ201310601425
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】李立和, 张超, 白会仓, 丁弘, 郭秋红 申请人:天津市宝坻区人民医院