专利名称：依非韦伦肝细胞毒性分子标志物及其应用的制作方法
依非韦伦肝细胞毒性分子标志物及其应用技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及依非韦伦(efavirenz，EFV)肝细胞毒性分子标志物及其应用，具体涉及D-3-磷酸甘油脱氢酶在制备检测肝细胞毒性分子标志物中的用途。
背景技术：
艾滋病全称为“获得性免疫缺陷综合征”(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)。截至2010年底，我国确诊艾滋病病毒感染者和病人约37万，其中2010 年新发艾滋病人数15982例，给我国政治和经济造成极大的影响。高效联合抗逆转录病毒治疗(Highly Active Antiretroviral Therapy,HAART)是目前治疗艾滋病最主要的方案， 是改善患者预后，提高患者生存质量的主要途径。目前有如下5类药物可供临床选择:核苷类反转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、整合酶抑制剂及融合抑制剂。其中NNRTI类药物有3个:依非韦伦(efavirenZ，EFV)、奈韦拉平 (nevirapine, NVP)和地拉韦啶(delavirdine)。依非韦伦EFV为国际艾滋病治疗指导方针推荐的非核苷类(NNRTI)首选药物，联合2个核苷类(NRTI)药物可作为抗HIV感染的一线治疗方案。但是EFV耐药屏障低[1]，HIV-1反转录酶(RT)单一位点突变株对依非韦伦耐药，为此临床和科研工作者进行大量的病毒耐药基因检测工作；此外，EFV有较严重的肝损，皮肤过敏反应和神经系统毒性U2。队列研究1显示:EFV治疗导致8.0%肝损伤(312个入选患者)，NVP治疗肝损伤的比率为15.6% (256例入选)。结核3、病毒性肝炎及联合应用蛋白酶抑制剂(PD会增加肝损伤的比率。
人体CYP2B6代谢酶的多态性是EFV肝毒性的一个重要原因。Katsounas A等4 对576艾滋病患者进行依非韦伦EFV血药浓度检测，发现EFV的浓度在1000-4000ng/mL之间能较好的控制HIV，超过4000ng/mL容易引起肝毒性。对于基因型为CYP2B6*6/6*或者 *6/26*的患者均出现516位的G变为T(516G- > T)，EFV的代谢减慢，导致血药浓度高达 6000ng/mL,出现神经毒性和肝毒性。当药物剂量被减少到400或200mg/天(标准剂量为 600mg/天)时，症状得到缓解5。
根据最新研究，另一个重要原因是EFV即使在临床浓度仍然能诱导细胞凋亡。EFV 能降低线粒体膜通透性、提高过氧化物等的产生、导致线粒体质量提高；EFV抑制O2消耗， 降低细胞内ATP的水平；EFV诱导细胞自吞。寻找线粒体凋亡过程中的变化分子，将能为EFV 肝毒性的预警提供标识分子。发明内容
本发明的目的在于提供依非韦伦肝细胞毒性分子标志物及其应用，具体涉及 D-3-磷酸甘油脱氢酶在制备检测肝细胞毒性分子标志物中的用途。
本发明通过蛋白质组学的方法在依非韦伦(EFV)肝细胞毒性模型中发现NADH脱氢酶为与肝毒性成正相关的蛋白质，经定量PCR和免疫印迹实验从mRNA和蛋白质的水平验证了该蛋白质的表达。本发明实验结果显示，D-3-磷酸甘油 脱氢酶可用作检测EFV肝细胞毒性的分子标志。
本发明通过建立肝毒性的细胞模型，利用蛋白质组学方法筛选在依非韦伦EFV处理致线粒体毒性和未经处理的肝细胞中差异表达的蛋白质，结果显示了与肝细胞毒性正相关的蛋白质(在EFV处理组中高表达)，经质谱鉴定确定为D-3-磷酸甘油脱氢酶；进一步的荧光定量PCR和免疫印迹实验证实，该蛋白质在不同浓度的EFV处理组中均比未经处理的高表达，且该D-3-磷酸甘油脱氢酶与EFV肝细胞毒性呈正相关。本发明结果表明，以该蛋白质的转录本作为一个分子标志对其转录水平进行定量检测可用作检测EFV肝细胞毒性。
本发明的另一个目的在于提供D-3-磷酸甘油脱氢酶特异性的引物与抗体(包括单克隆抗体和多克隆抗体)，用于制备检测EFV肝细胞毒性制剂。
本发明的再一个目的在于提供一种D-3-磷酸甘油脱氢酶的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，用于制备检测EFV肝细胞毒性的试剂盒。
本发明的进一步目的在于提供一种体外检测EFV肝细胞毒性细胞中D-3-磷酸甘油脱氢酶表达是否异常的方法，该方法包括以下步骤:
A、用特异性抗体或者定量PCR技术检测待检肝细胞中D-3-磷酸甘油脱氢酶的数量;
B、将步骤A所得到的数量与正常肝细胞中D-3-磷酸甘油脱氢酶的数量进行比较， 如测得的高于正常值，则表示被检样本中D-3-磷酸甘油脱氢酶的表达异常。
本发明提供了以D-3-磷酸甘油脱氢酶作为一个分子标志对其表达水平进行检测可以用于检测EFV肝细胞毒性。进一步的可用于制备检测EFV肝毒性的制剂或试剂盒等， 本发明的D-3-磷酸甘油脱氢酶与EFV肝细胞毒性的相关性将为EFV肝毒性的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。
下面结合具体附图和实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些附图和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
图1:二维凝胶电泳显示D-3-磷酸甘油脱氢酶的表达量(EFV代表未处理的肝细胞，2.5代表2.5 μ g/L的EFV处理，10代表10 μ g/L的EFV处理；圆圈所指处代表D-3-磷酸甘油脱氢酶所在的位置。
图2:D-3-磷酸甘油脱氢酶的荧光定量PCR，
EFV代表未处理的肝细胞，2.5代表2.5 μ g/L的EFV处理，10代表10 μ g/L的EFV 处理，GAPDH为内参对照。
图3中显示了 D-3-磷酸甘油脱氢酶在EFV处理的肝细胞中有较高水平的表达。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件参考《分子克隆实验指南》(第三版，冷泉港出版社)中所 述的条件或者制造厂商的建议条件。
本发明以不同浓度的EFV刺激肝癌细胞系，通过检测ROS的量来监测线粒体的凋亡情况，收集未处理和2.5 μ g/L以及10 μ g/L的EFV处理I小时的肝癌细胞，裂解获得细胞蛋白质后，以蛋白质二维凝胶电泳的方法分离蛋白质，通过ImageMaster软件分析表达差异的蛋白质，并对所获得的差异蛋白质进行质谱鉴定，结果显示，D-3-磷酸甘油脱氢酶在 EFV处理的两组样品中均高表达；荧光定量PCR实验进一步证实D-3-磷酸甘油脱氢酶在 EFV处理的肝细胞中的高表达。
实验结果表明，以D-3-磷酸甘油脱氢酶作为一个指标对其表达量进行检测可以用来检测EFV肝毒性，即D-3-磷酸甘油脱氢酶可作为EFV肝毒性的分子标志。
实施例1制备未处理和EFV处理的肝细胞线粒体蛋白质样品
本实施例中所使用的细胞培养基DMEM购自Invitrogen公司，葡聚糖T500、聚乙二醇3350、尿素、硫脲、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫苏糖醇(DTT)、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-1-丙横酸(CHAPS)均购自Sigma公司，EFV购自美国药典(U.S Pharmacopeia)。
本实施例用不同浓度的EFV处理，于不同的时间进行ROS的检测，结果显示，ROS 的产生量与EFV成时间和浓度依赖性(如图1所示)，本实施例选定2.5 μ g/L和10 μ g/L 的EFV处理肝癌细胞(Huh7) I小时的细胞进行实验:收集细胞匀浆破碎，用双水相离心的方法分离线粒体，将获得的线粒体加入裂解缓冲液(8mol/L尿素、4% CHAPS,65mmol/L DTT, 2mol/L硫尿、I % NP-40,0.5mmol/L PMSF、I % DNA酶)，在冰上作用30min，再在室温下孵育 30min，用Bradford法测定裂解得到的蛋白质含量后，_80°C保存备用。
实施例2筛选差异表达蛋白质
本实施例中所使用的丙烯酰胺、N, N'-亚甲基双(丙烯酰胺)、甘氨酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、三轻甲基氨基甲烧(Tris)、尿素、甘油购自美国Amresco公司，过硫酸胺 (AP)、TEMED 购自 Bio-Rad。
将裂解得到的蛋白质通过二维凝胶电泳的方法分离，通过ImageMaster 2D Platinum 6.0软件分析，获得差异表达的蛋白质，并对所获得的差异蛋白质用戴安纳升级液相色谱Ultimate3000串联高容量离子阱质谱(LC-MS/MS)进行分离鉴定。具体步骤如下:
双向凝胶电泳的第一向等电聚焦电泳采用pH 3 10非线性胶条，电泳程序设置:水化 30V，12h ;电泳:500V, Ih ；1000V, Ih ;8000V，30min，梯度;8000V，5h，线性;总功率达44千瓦，第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，分离胶浓度为11.5%,电泳结束,剥胶,考马斯亮蓝染胶，Image scanner扫描仪成像,用ImageMaster 2D Platinum 6.0软件将电泳图谱分成2个类别进行找点、匹配等分析，找出差异蛋白质点。
取差异蛋白质点脱色脱水冻干后,每管中加入约5μ L胰酶(0.02μ g/μ L)。37 °C 酶解过夜(16 18h)，酶解后的样品先经过C18预柱(300yL idx5mm,5ym)脱盐，流速为 20μ L/min，流动相为2% ACN，0.1% FA。然后以300nL/min的流速经C-18反向柱(75 μ m id X 15cm length, 3 μ m, PepMapTM)进行分离,色谱的梯度为4-48%,梯度时间为40min。 通过C18色谱柱分离的肽段由纳流喷针进入HCT质谱进行实时的离子化分析检测；HCT质谱每秒钟进行一次一级扫描和5次二级扫描分析。
用DataAnalysis 3.2软件整合肽指纹图谱和串联质谱二级图谱,通过Mascot 软件查询SwissProt数据库；MS误差:±0.6Da，MS/MS误差:1.2Da.固定修饰是半胱氨酸被修饰为脲甲基半胱氨酸(Carbamidomethyl-Cys),可 变修饰为甲硫氨酸氧化 (Oxidation (M))，每个肽段允许有I个不完全裂解位点，离子选择(+1，+2，+3)，模式为:单同位素，置信区间为95%，P < 0.05，蛋白质得分36分以上结果可靠。
鉴定获得12种非冗余蛋白质在EFV处理和未处理组中差异表达，其中包括在EFV 处理组(肝细胞毒性)中高表达的蛋白质D-3-磷酸甘油脱氢酶(如图2所示)，考马斯亮蓝染色的双向凝胶电泳显示D-3-磷酸甘油脱氢酶在纤维化过程中表达下调(如图2所示:6、9代表酒精性肝纤维化的不同时间点，N代表组织来源于正常肝脏，A代表组织来源于肝纤维化肝脏，圆圈代表膜联蛋白A3所在的位置)。
表I为质谱分析获得的膜联蛋白A3的鉴定结果。
表I
权利要求
1.D-3-磷酸甘油脱氢酶在制备肝细胞毒性分子标志物中的用途。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝细胞毒性分子标志物是抗艾滋病病毒药物依非韦伦肝细胞毒性预警的蛋白质分子标记或药物靶标。
3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测肝细胞毒性分子标志物是检测 D-3-磷酸甘油脱氢酶蛋白在肝细胞中的表达量。
4.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的D-3-磷酸甘油脱氢酶蛋白在肝细胞中的表达量是检测该蛋白在肝细胞中转录是否存在上调。
5.D-3-磷酸甘油脱氢酶在制备检测依非韦伦肝细胞毒性制剂中的用途，所述制剂中包括D-3-磷酸甘油脱氢酶特异性的引物和抗体。
6.D-3-磷酸甘油脱氢酶在制备检测依非韦伦肝细胞毒性试剂盒中的用途，所述试剂盒中包括D-3-磷酸甘油脱氢酶特异性抗体。
7.如权利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述抗D-3-磷酸甘油脱氢酶的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
8.—种体外检测EFV肝细胞毒性细胞中D-3-磷酸甘油脱氢酶表达是否异常的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:A、用特异性抗体或者定量PCR技术检测待检肝细胞中D-3-磷酸甘油脱氢酶的数量；B、将步骤A所得到的数量与正常肝细胞中D-3-磷酸甘油脱氢酶的数量进行比较，如测得的高于正常值，则表示被检样本中D-3-磷酸甘油脱氢 酶的表达异常。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及依非韦伦(EFV)肝细胞毒性分子标志物及其应用，尤其涉及D-3-磷酸甘油脱氢酶在制备检测肝细胞毒性分子标志物中的用途。本发明通过肝毒性的细胞模型，用蛋白质组学方法筛选以及荧光定量PCR和免疫印迹实验，获得与肝细胞毒性正相关的蛋白质D-3-磷酸甘油脱氢酶；该蛋白质在不同浓度的EFV处理组中均比未经处理的高表达，且该D-3-磷酸甘油脱氢酶与EFV肝细胞毒性呈正相关。本发明结果表明，以该蛋白质的转录本作为一个分子标志对其转录水平进行定量检测可用作检测EFV肝细胞毒性。所述的D-3-磷酸甘油脱氢酶特异性的引物与抗体可用于制备检测EFV肝细胞毒性制剂，和制备检测EFV肝细胞毒性的试剂盒。
文档编号C12Q1/32GK103215341SQ20121001884
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者张丽军, 马芳, 贾小芳, 周宏灏 申请人:中南大学, 上海市公共卫生临床中心