一种乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法，首先活化乳酸片球菌PA003菌种于液体MRS培养基中，利用生长培养基进行培养，使其活性及存活性最佳；然后利用冷冻离心机离心法收集菌体，洗涤后，将菌体悬浮于已灭菌的冷冻干燥保护剂培养基中，通过逐步冷冻法将溶液冷冻，待其结冰后准备进行冷冻干燥；最后将结冰样品放置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥；最后获得的冷冻干燥制剂密封避光放置于室温下贮藏。用本发明制备的乳酸片球菌存活率高达81.96%，复性后具有乳酸菌属的发酵特性的同时仍保持对单核增多症李斯特氏菌的抑菌活性，适于开发后大规模工业化生产，在食品业和饲料业中作为生物防腐剂或是饲料添加剂使用具有很大的潜力。
【专利说明】一种乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种冷冻干燥制剂的制备方法，特别涉及一种乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法及使用方法。
【背景技术】
[0002]自人类使用乳酸菌生产发酵食品以来至少已有4000多年的历史，主要用于生产发酵乳制品、发酵蔬菜和发酵肉制品等。乳酸菌发酵食品风味独特，对人类和动物有益生作用，甚至有些菌种具有防腐作用，这些乳酸菌在世界范围内深受喜爱。目前，乳酸片球菌能赋予食品柔和的酸味及香气，改进食品的品质和营养，还具有抗菌、降低胆固醇、维持微生态环境、抗肿瘤、抗变异和增强免疫力等重要生物学功能。其作为发酵菌种已经大量的在多国的食品中使用，是备受人们喜爱和接受的有益菌群。此外，其显著的抑菌效果，使得乳酸片球菌潜藏着巨大的应用价值和广阔的应用前景。
[0003]国内外目前对于乳酸片球菌抑菌作用的研究大多都致力于片球菌素的研究上，主要是通过各种方法获得高效高产量的片球菌素，如:优化培养及各种条件，基因工程技术等方法来获得高效高产量的细菌素。但作为人体有益菌的乳酸菌属乳酸片球菌，其活菌的使用及活菌抑菌试验的研究报道却在国内外鲜见。本发明所用乳酸片球菌菌株(pediococcusacidilatici) PA003是天津大学化工学院周志江教授研究室的特有菌种，最初从一种发酵白菜(东北酸白菜)中分离纯化得到的(已在专利CN102115720B中公开，可从天津大学化工学院食品科学系食品生物技术研究室获取)。此乳酸片球菌PA003能发酵糖类生成片球菌素——是一种多肽的天然生物防腐剂，属于热稳定多肽细菌素，可以抑制很广范围内的革兰氏阳性菌，具有广谱抗菌性。而该片球菌是乳酸细菌的一个种，既能发酵一些食品，又具备防腐功能，人们还可以直接食用，其作为天然物质进行使用时比目前备受争议的转基因物质和人工合成物质或化合物更能得到大众的认可和接受。
[0004]目前国内外尚未见乳酸片球菌冷冻干燥制剂研究的报道，因此，为了保证制作出的冷冻干燥制剂能稳定的长期贮藏，且复性后具有较高的存活率和较稳定的抑菌活性，以及在操作，贮藏，销售，使用中更加方便可行，就必须针对制备乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的各种影响因素进行认真研究。而从技术和商业相结合的角度出发，菌种的生长及其进行冷冻干燥、复性、冷冻干燥后长期贮藏过程中受到的影响都是该冷冻干燥制剂在复性后具有高活性和高生存能力的重要研究核心。而上述研究过程中的主要的影响因素又分为:固有的内在因素，包括:细胞的大小、遗传基因、细胞壁和细胞膜的组成；生长因素，包括:可兼容溶质积累物、胞外多糖的产生、细胞膜的变化；半致死处理；干燥培养基，包括:脱脂牛奶粉、渗透性化合物、半渗透性化合`物、不渗透的化合物；贮藏和复性，贮藏包括:氧气、水分、温度，复性包括:复性液的PH值、温度、容量、营养物质成分和含量、能量物质成分和含量。因此，针对不同影响因素对于菌属中不同的种有不同的影响结果，不同种之间的最适条件也不相同等可能出现的问题，再加上乳酸片球菌PA003菌株在制作为冷冻干燥制剂后，后期使用和长期储存过程中必须具备抑菌活性，那么必须对冷冻干燥法制备冷冻干燥制剂及复性过程中影响乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂存活率和抑菌活性的三大影响因素(即:生长培养基，冷冻干燥保护剂，复性条件)进行逐一研究。研制出制备乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的最佳方法。最终能让乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂有效地，合理地，方便地作为天然生物防腐剂、发酵剂、饲料添加剂运用到各种食品和相关产业中。从而显现出乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂天然，无害，无污染，安全的发酵功能和生物防腐功效。以上的所有研究发明都是具很高的研究价值和意义的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法，填补国内外乳酸片球菌冷冻干燥制剂的空白，解决乳酸片球菌菌株应用于大规模工业化生产困难的问题。
[0006]本发明是通过如下技术方案实现的:
[0007]一种乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法，包括如下步骤:
[0008](I)活化乳酸片球菌PA003菌种于液体MRS培养基中，利用生长培养基进行培养，使其活性及存活性最佳；
[0009](2)利用冷冻离心机离心法收集菌体，洗涤后，将菌体悬浮于已灭菌的冷冻干燥保护剂培养基中，通过逐步冷冻法将溶液冷冻，待其结冰后准备进行冷冻干燥；
[0010](3)将结冰样品放置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥；最后获得的冷冻干燥制剂密封避光放置于室温下贮藏。
[0011]所述步骤(1)中生长培养基为10%(w/v)脱脂奶作为溶液基质的MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培养基。所述MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培养基配方是指将葡萄糖0.66%，果糖
0.66%，蔗糖0.66%代替MRS培养基`配方的葡萄糖2%。
[0012]所述步骤(1)中接种量为1%，培养温度37°C，培养时间14h。
[0013]所述步骤(2)冷冻干燥保护剂培养基为5%蔗糖的10%(w/v)脱脂奶溶液。
[0014]所述步骤(2)冷冻离心机转速1000Orpm,在4°C下离心lOmin。
[0015]所述步骤(3)冷冻干燥温度-53°C，冷冻干燥时间24h。
[0016]一种乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的使用方法，使用时利用生理盐水作为复性液在22°C下进行复性30min。
[0017]本发明的有益效果为:本发明利用改良后的MRS培养基，该乳酸片球菌的生长能达到最佳。用本发明制备的乳酸片球菌存活率高达81.96%，复性后具有乳酸菌属的发酵特性的同时仍保持对单核增多症李斯特氏菌的抑菌活性，适于开发后大规模工业化生产，在食品业和饲料业中作为生物防腐剂或是饲料添加剂使用具有很大的潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1不同糖类(基质为蒸馏水)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；
[0019]图2不同糖类(基质为10% (w/v)脱脂奶)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；
[0020]图3不同大分子聚合物(基质为蒸馏水)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；
[0021]图4不同大分子聚合物(基质为10% (w/v)脱脂奶)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；
[0022]图5不同多元醇(基质为蒸馏水)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；
[0023]图6不同多元醇(基质为10% (w/v)脱脂奶)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；
[0024]图7其他化合物(基质为蒸馏水)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；
[0025]图8其他化合物(基质为10% (w/v)脱脂奶)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；[0026]图9a复性液对乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂存活率的影响；
[0027]图9b复性液对乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂存活率的影响；
[0028]图10复性温度对乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂存活率的影响；
[0029]图11复性时间对乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂存活率的影响；
[0030]图12乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂抑制单核增多症李斯特氏菌CVCC1595的抑菌活性。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图对本发明作详细说明。
[0032]实施例1
[0033]制备乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂
[0034](I)将贮藏于4°C下MRS斜面上的乳酸片球菌PA003菌种按1%的接种量接种于液体MRS培养基中，接种后于37°C下培养14h，将液体MRS菌悬液再按1%的接种量接种于液体生长培养基中，放置于37°C下培养14h。
[0035](2)利用冷冻离心机离心(10000rpm,4°C, IOmin),弃上清，收集固体沉淀(菌体)；用同体积已灭菌的Ringer’ s solution洗漆两次，同样弃上清,收集固体沉淀(菌体)；此后将菌体悬浮于已灭菌的冷冻干燥保护剂培养基中，于25°C静置lh，之后于4°C下再静置lh，最后将其放置于-20°C静置，待其结冰后准备进行冷冻干燥。
[0036](3)将结冰样品放置于冷冻干燥机中(_53°C )进行冷冻干燥24h ;获得的冷冻干燥制剂密封避光放置于室温下贮藏。
[0037]实施例2
[0038]乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的存活率
[0039]( I)冷冻干燥前乳酸片球菌菌株的活菌计数:在上述25°C静置Ih后，从冷冻干燥保护剂培养基中各取出ImL该保护剂的菌悬液加入到9mL已灭菌的生理盐水中，将其经过适当稀释后，即达到10_6、10_7时，将该稀释梯度下的菌悬液各取100 u L加到MRS固体培养基平皿上进行菌落涂布(相邻两个梯度各涂布3块平皿)，涂布好的平皿放置于37°C下培养48h，之后进行平板菌落计数。存活的菌落数用cfu/mL来表示。
[0040](2)冷冻干燥后，立刻用同体积的复性液对冷冻干燥制剂进行复性，使其在复性条件下形成复性菌悬液。从该复性菌悬液中各取出ImL菌悬液加入到9mL已灭菌的生理盐水中，将其经过适当稀释后达到10_6、10_7，将该稀释梯度下的菌悬液取IOOyL加到MRS固体培养基平皿上进行菌落涂布(相邻两个梯度各涂布3块平皿)，涂布好的平皿放置于37°C下，培养48h后进行菌落计数。存活的菌落数用cfu/mL来表示。
[0041](3)存活率是通过冷冻干燥前(No)，后(Nf)对应的MRS固体培养皿上菌落数的比值来表示的:存活率(V) %= (Nf/No) X 100两次平行试验的数值利用Software SPSS 18.0统计学软件来进行处理，方差分析用一般线性模型(GLM)方差分析；多重比较利用新复极差法进行分析。
[0042]实施例3
[0043]乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的抑菌活性
[0044]把冷冻干燥后的乳酸片球菌PA003从复性液中接种到MRS固体培养皿中，放置于37°C下培养24h，待其长出肉眼可见菌落；在50°C左右的5mL半固体TSYEB中接入I y L单核增多症李斯特氏菌CVCC1595，将其混匀后倾倒入上述已长出肉眼可见菌落的MRS固体培养皿中，使该层半固体培养基平铺于固体MRS培养基之上，之后将该平板放置于37°C下培养12h，观察是否在乳酸片球菌菌落周围出现抑菌圈。(图12)
[0045]由图12看出，制作出的冷冻干燥制剂进行复性后，对存活的乳酸片球菌PA003进行抑菌试验，发现该菌落周围都可以看到清晰的抑菌圈，表明该冷冻干燥制剂仍具有稳定的抑菌活性。 [0046]实施例4
[0047]优化制备乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂制备过程中的各影响因素
[0048](1)在制备冷冻干燥制剂过程中通过利用两因素全面实验，对乳酸片球菌菌株的生长培养基进行优化，最终选择出最佳制备冷冻干燥菌制剂的生长培养基，即10%(w/v)脱脂奶作为溶液基质的MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培养基。(表1、2、3、4)
[0049]表1不同生长培养基
[0050]
【权利要求】
1.一种乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)活化乳酸片球菌PA003菌种于液体MRS培养基中，利用生长培养基进行培养，使其活性及存活性最佳； (2)利用冷冻离心机离心法收集菌体，洗涤后，将菌体悬浮于已灭菌的冷冻干燥保护剂培养基中，通过逐步冷冻法将溶液冷冻，待其结冰后准备进行冷冻干燥； (3)将结冰样品放置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥；最后获得的冷冻干燥制剂密封避光放置于室温下贮藏。
2.根据权利要求1所述乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中生长培养基为10%(w/v)脱脂奶作为溶液基质的MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培养基。
3.根据权利要求2所述乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法，其特征在于，所述MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培养基配方是指将葡萄糖0.66%，果糖0.66%，蔗糖0.66%代替MRS培养基配方的葡萄糖2%。
4.根据权利要求1所述乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中接种量为1%，培养温度37°C，培养时间14h。
5.根据权利要求1所述乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)冷冻干燥保护剂培养基为5%蔗糖的10%(w/v)脱脂奶溶液。
6.根据权利要求1所述乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)冷冻离心机转速1000Orpm,在4°C下离心lOmin。
7.根据权利要求1所述乳酸片球菌菌`株冷冻干燥制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)冷冻干燥温度-53°C，冷冻干燥时间24h。
8.一种乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的使用方法，其特征在于，使用时利用生理盐水作为复性液在22°C下进行复性30min。
【文档编号】C12N1/04GK103627637SQ201310631973
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】韩烨, 洪小迪, 谭茜倩, 周志江 申请人:天津大学