一种复合微生物激活剂及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种复合微生物激活剂及其制备方法与应用。所述复合微生物激活剂由以下A和B两组微生物菌剂制成：A组包括甲基营养型芽孢杆菌UTM401，厌氧芽孢杆菌UTM501，厌氧芽孢杆菌UTM601，极端嗜热菌UTM801中的一种或几种；B组包括地芽孢杆菌UTM01，地芽孢杆菌UTM02，芽孢杆菌UTM03中的一种或几种。本发明可大大提高堆肥初期微生物的群体，增强代谢活性，起温快，促进高温发酵进程，显著促进堆肥进程和提高堆肥质量。
【专利说明】一种复合微生物激活剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境微生物【技术领域】，具体地涉及一种复合微生物激活剂及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]堆肥接种是指从多样化的环境或物料中分离驯化有益微生物，并通过培养发酵形成菌剂接种至堆料中的一种方法。通常将这些用于堆肥接种的单一或复合微生物菌剂叫堆肥接种剂或发酵接种剂。目前，堆肥接种剂已被广泛应用于有机固废堆肥发酵，并且还有新的接种剂在开发中，但多集中在中温好氧微生物的开发上，在应用上仍存在一些局限性。
[0003]一方面，当堆肥温度达到60°C以上时，堆肥微生物就会出现明显的被抑制状态，因此，为了保证常用堆肥接种剂能发挥其有效的作用潜力，目前的好氧堆肥中，需采取翻堆、鼓风等措施来使堆体维持一定的氧浓度(8~15%)和堆肥温度不超过65°C。这不仅增加能耗，提高成本，还忽视了堆肥高温期是堆肥过程中有机物高速降解和保证卫生无害化效果的重要地位,也使生产操作复杂化。
[0004]再者，堆肥中本身还含有一定数量的有益微生物，如能通过某种方式将其激发，也将大大促进堆肥进程，尽管已有专利(堆肥催化腐剂:ZL92106566.3)根据微生物的营养机理，利用化学试剂制备出堆肥催腐剂，可大大加速天然有益菌的繁殖和堆肥怄制腐熟过程，但仍未能克服内源堆肥有益菌难以适应堆肥高温期高温高湿低氧的恶劣微环境这一瓶颈。
[0005]因此，有必要通过堆肥接种的方式，向堆肥物料中引入适于堆肥高温期环境的嗜热微生物，并引入激发内源微生物的物质，通过内外源微生物的协同代谢作用，最大限度的激发堆肥微生物的发酵潜力，促进堆肥进程，实现快速堆肥。然而，目前还尚未见到有此类堆肥接种剂的公开报道。
【发明内容】
[0006]为解决上述技术问题，本发明目的是提供一种复合微生物激活剂。
[0007]本发明另一目的是提供一种制备上述复合微生物激活剂的方法。
[0008]本发明又一目的是提供上述复合微生物激活剂在堆肥中的应用。
[0009]本发明的复合微生物激活剂，包括以下A和B两组微生物菌剂制成:
[0010]A组:甲基营养型芽抱杆菌(Bacillus methylotrophicus)UTM401CGMCC N0.5927,厌氧芽抱杆菌(Anoxybacillus mongoliensis) UTM501CGMCC N0.5928,厌氧芽抱杆菌(Anoxybacillus pushchinoensis) UTM601CGMCC N0.5929,极端嗜热菌(Calditerricolayamamurae) UTM801CGMCC N0.6185 中的一种或几种；
[0011]B 组:地芽孢杆菌(Geobacillus sp.) UTM01CGMCC N0.5641，地芽孢杆菌(Geobacillus sp.) UTM02CGMCC N0.5642，芽孢杆菌(Bacillus sp.) UTM03CGMCC N0.5643中的一种或几种。
[0012]所用菌株保存于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，保藏号依次是为:
[0013](1) Bacillus methylotrophicus.UTM401:CGMCC N0.5927 (该菌株的保藏证明及其保藏号已经在专利申请号为201210226954.5专利上公开)、(2) Anoxybacillussp.UTM501:CGMCC N0.5928 (该菌株的保藏证明及其保藏号已经在专利申请号为201210227177.6 专利上公开)、(3) Anoxybacillus sp.UTM601:CGMCC N0.5929 (该菌株的保藏证明及其保藏号已经在专利申请号为201210226967.2专利上公开)、(4)Calditerricola yamamurae.UTM801:CGMCC N0.6185 (该菌株的保藏证明及其保藏号已经在专利申请号为 201210343222.4专利上公开)、(5)Geobacillus sp.UTM01:CGMCC N0.5641(该菌株的保藏证明及其保藏号已经在专利申请号为201210176596.1专利上公开)、(6)Geobacillus sp.UTM02:CGMCC N0.5642 (该菌株的保藏证明及其保藏号已经在专利申请号为 201210177294.6 专利上公开)、(7)Bacillus sp.UTM03:CGMCC N0.5643 (该菌株的保藏证明及其保藏号已经在专利申请号为201210177647.2专利上公开)。
[0014]所述的复合微生物激活剂还包括助料，所述助料为氯化亚铁、硫酸镁、硝酸钠和石灰，其中氯化亚铁:硫酸镁:硝酸钠:石灰重量比为0.05~0.15:0.01~0.03:0.02~0.05:0.05~0.15。所述复合微生物激活剂的活菌数为2.4-4X108个/g。
[0015]本发明提供的堆肥接种用UTM发酵复合微生物激活剂的制备方法包括如下步骤:
(1)菌种的活化:将菌株斜面转接至活化培养基平板上，培养至丰厚；
[0016](2)发酵种子液制备:将步骤(1)中的菌种扩大培养；
[0017](3)发酵激活剂制备:选择主料与辅料及调理剂混合，然后分别接种步骤(2)中的发酵种子液，将物料风干过筛后添加助料。
[0018]步骤(1)中，保存菌种的活化方法是:将4°C保存的生产菌株斜面转接至活化培养基平板上,培养至丰厚。其中UTM401、UTM501、UTM601、UTM01、UTM02、UTM03采用LB培养基；UTM801采用改良YTPG培养基。
[0019]LB培养基配方为:胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg，植物凝胶10g，琼脂15g。
[0020]改良YTPG培养基配方为:酵母提取物1.5~2.5g/L，细菌蛋白胨1.5~2.5g/L，葡萄糖 1.5 ~2.5g/L, PIPES4.5 ~7.5g/L，浸提液 1000ml/L, ρΗ7.2 ~7.4 (用固态 NaOH调节)，植物凝胶8~12g/L，琼脂15~20g/L ;浸提液制备方法:称取50g~100g —次发酵后腐熟堆肥(含水率小于30%)，加入250ml蒸馏水，在室温下，150~200rpm振荡8~16小时；取振荡液在3000~4000rpm下离心5~20min，收集上清液，得浸提液母液，在4°C保存备用；使用时，用蒸馏水稀释1~3倍即为培养基浸提液。
[0021]步骤(2)中，发酵种子液制备采用常规的发酵方式进行多级扩培2~4代。其中UTM401、UTM501、UTM601、UTM01、UTM02、UTM03扩培培养基为LB培养液，各级扩培种子液的0D600在1.5~3.0之间停止培养；UTM801的扩培培养基为改良YTPG培养液，培养2_3天 停止;
[0022]其中，一级种子液采用恒温水浴摇床振荡培养，转速150~200prm ;二级种子液采用发酵罐培养方式，发酵条件为:接菌量(v/v) 3%-10%，罐装量(v/v) 70%-80%，间歇通风搅拌:每间隔4-6小时通气10-30分钟，通气量(v/v)0.8-1.5:1，每隔8~12小时搅拌10-20分钟，转速150-180rpm，培养2-7天。
[0023]步骤(1)、步骤(2)中，保存菌种的活化和扩培培养温度分别是:UTM40125~40°C;UTM50150 ~60°C ；UTM60150 ~60°C ;UTM01、UTM02、UTM0360 ~70°C ；UTM80170 ~80°C。
[0024]步骤(3)中，所述主料为木薯加工废弃物，辅料为猪粪和草木灰，调理剂为玉米面或麦麸；所述木薯加工废弃物、猪粪、草木灰、玉米面或麦麸的混合比例是:(3~4):(1~
3): (0.8~1.2): (0.2~0.5);所述物料混合后发酵堆的高度为1.2~2.0米。
[0025]所述各发酵种子液的接种方法是:
[0026]接种方式:用适量的调理剂吸附重量百分比相当于总物料干重0.2%~0.5%的发酵种子液后，均匀撒于物料混合均匀；
[0027]接种时机:当发酵最高温度达到50~60°C时接种UTM501、UTM601及当发酵最高温度达到65°C时接种UTM01、UTM02、UTM03中的1~3种发酵种子液；当发酵最高温度达到70°C时接种UTM801 ;发酵最高温度降至38~45°C接种UTM401发酵种子液。
[0028]发酵管理:当发酵最高温度达到70V以上维持1~2天后，每隔2~5天翻堆一次，直至温度下降稳定于环境温度。
[0029]所述助料及助料添加至风干物料的重量比为:氯化亚铁(0.08%~0.12%)、硫酸镁(0.01% ~0.03%)、硝酸钠(0.02% ~0.04%)石灰(0.05% ~0.15%)。 [0030]本发明提供的堆肥接种用UTM发酵复合微生物激活剂的应用方法是:在堆肥初期，按重量比2~5%添加至堆肥中。
[0031]本发明的有益效果是:
[0032]本发明提供的堆肥接种用UTM发酵复合微生物激活剂，含有中温发酵菌种，可大大提高堆肥初期微生物的群体，增强代谢活性，起温快；该激活剂中含有有益嗜热菌种，可克服现有堆肥接种剂在堆肥高温期活力受抑制的问题，促进高温发酵进程；该激活剂中含有多种微生物激发成分，可最大限度的激活堆肥中有益菌的代谢功能，定向培养微生物群落结构和功能，使内、外源微生物形成协同互作体系，发挥发酵潜质，显著促进堆肥进程和提高堆肥质量。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为堆肥过程温度变化；
[0034]图2为堆肥过程有机物含量变化；
[0035]图3为堆肥过程发芽指数变化。
【具体实施方式】
[0036]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0037]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0038]实施例1微生物菌种的活化
[0039]1)将4°C保存的UTM401生产菌株斜面转接至LB培养基平板上，在30°C培养至丰厚。
[0040]2)将4°C保存的UTM501、UTM601生产菌株斜面转接至LB培养基平板上，在55°C培养至丰厚。
[0041]3)将4°C保存的UTM01、UTM02、UTM03生产菌株斜面转接至LB培养基平板上，分别在60°C、60°C、65°C培养至丰厚。
[0042]4)将4°C保存的UTM01、UTM02、UTM03生产菌株斜面转接至LB培养基平板上，均在65 °C培养至丰厚。
[0043]5)将4°C保存的UTM01、UTM02、UTM03生产菌株斜面转接至LB培养基平板上，分别在601:、651:、651:培养至丰厚。
[0044]6)将4°C保存的UTM801生产菌株斜面转接至改良YTPG培养基平板上，在75°C培
养至丰厚。
[0045]实施例2微生物发酵种子液的制备
[0046]1) UTM401发酵种子液制备
[0047]用无菌玻璃刮刀将在LB平板上活化培养至丰厚的UTM401菌落全部转接至装有2000ml LB液体培养基的5000ml三角瓶中，在振荡器上30°C，转速160r/min下震荡培养3天，此时0D600为1.8，停止培养，此为一级发酵种子液。
[0048]将一级发酵种子液接种至发酵种子罐中进行发酵培养。发酵条件为:接菌量(v/v) 10%，罐装量(v/v) 80%，间歇通风搅拌:每间隔4小时通气10分钟，通气量(v/v) 1:1，每隔8小时搅拌10分钟，转速160rpm，30°C培养3天后，检测其0D600为2.5，停止培养，此为UTM401发酵种子液。
[0049]2) UTM501和UTM601发酵种子液制备
`[0050]用无菌玻璃刮刀将在LB平板上活化培养至丰厚的UTM501和UTM601菌落分别全部转接至装有2000ml LB液体培养基的5000ml三角瓶中，在振荡器上50°C，转速160r/min下震荡培养3天，此时0D600分别为2.2和2.5，停止培养，此为一级发酵种子液。
[0051]将一级发酵种子液分别接种至发酵种子罐中进行发酵培养。发酵条件为:接菌量(v/v) 10%，罐装量(v/v) 75%,间歇通风搅拌:每间隔5小时通气20分钟,通气量(v/v)
0.8:1，每隔10小时搅拌15分钟，转速150rpm，50°C培养3天后，检测其0D600分别为2.6和2.7，停止培养，此为UTM501和UTM601发酵种子液。
[0052]3)UTM801发酵种子液制备
[0053]用无菌玻璃刮刀将在改良YTPG培养基平板上活化培养至丰厚的UTM801菌落全部转接至装有2000ml液体改良YTPG培养基的5000ml三角瓶中，在水浴振荡器中80°C恒温下，转速160r/min下震荡培养2天后停止培养，此为一级发酵种子液。
[0054]将一级发酵种子液分别接种至发酵种子罐中进行发酵培养。发酵条件为:接菌量(v/v)5%，罐装量(v/v)70%，间歇通风搅拌:每间隔6小时通气30分钟，通气量(v/v)0.8:1，每隔8小时搅拌20分钟，转速150rpm，80°C培养3天后停止培养，此为UTM801发酵种子液。
[0055]4) UTM01、UTM02、UTM03 发酵种子液制备
[0056]用无菌玻璃刮刀将在LB平板上活化培养至丰厚的UTM01、UTM02、UTM03菌落分别全部转接至装有2000ml LB液体培养基的5000ml三角瓶中，在振荡器上60_70°C，转速160r/min下震荡培养3天，此时0D600分别为2.4、1.5和2.9，停止培养，此为一级发酵种子液。
[0057]将一级发酵种子液分别接种至发酵种子罐中进行发酵培养。发酵条件为:接菌量(v/v) 10%，罐装量(v/v) 75%,间歇通风搅拌:每间隔5小时通气20分钟,通气量(v/v)
0.8:1，每隔10小时搅拌15分钟，转速150rpm，在60-70°C下培养4天后，检测其0D600分别为2.1、1.8和2.7，停止培养，此为UTM01、UTM02、UTM03发酵种子液。
[0058]实施例3发酵激活剂的制备
[0059]取木薯皮、木薯酒糟、猪粪、草木灰、玉米面按重量比2:2:2:0.8:0.2混合，使发酵堆高度为1.4米，每天多点检测发酵温度。根据温度变化，接种相当于初始物料干重0.3%的各发酵液，接种前分别用适量玉米面吸附各发酵种子液，接种后通过搅拌使混合均匀。各菌的接种时间为:当发酵最高温度达到55°C时接种UTM501、UTM601,当发酵最高温度达到65°C时接种UTM01，当发酵最高温度达到70°C时接种UTM801，并在70°C维持2天后；当发酵最高温度降至38°C时接种UTM401，每隔3天翻堆一次直至温度下降稳定于环境温度，将物料风干至含水率降至40%以下。
[0060]将风干物料过筛，然后添加助料:氯化亚铁(0.08%)、硫酸镁(0.02%)、硝酸钠(0.03%)石灰(0.05%)。混合均匀后即为本发明堆肥接种用UTM发酵激活剂。经检测发酵激活剂的总活菌数为3.1 X 108个/g。
[0061]实施例4发酵激活剂的制备
[0062]取木薯渣、猪粪、草木灰、玉米面按重量比3:1:1:0.4混合，使发酵堆高度为1.5米，每天多点检测发酵温度。根据温度变化，接种相当于初始物料干重0.5%的各发酵液，接种前分别用适量玉米面吸附各发酵种子液，接种后通过搅拌使混合均匀。各菌的接种时间为:当发酵最高温度达到55 °C时接种UTM501、UTM601,当发酵最高温度达到65°C时接种UTM01和UTM02，当发酵最高温度达到70°C时接种UTM801，并在70°C维持2天后；当发酵最高温度降至40°C时接种UTM401 ，每隔2天翻堆一次直至温度下降稳定于环境温度，将物料风干至含水率降至40%以下。
[0063]将风干物料过筛，然后添加助料:氯化亚铁(0.1%)、硫酸镁(0.01%)、硝酸钠(0.04%)、石灰(0.1%)。混合均匀后即为本发明堆肥接种用UTM发酵激活剂。经检测发酵激活剂的总活菌数为3.9X 108个/g。
[0064]实施例5发酵激活剂的制备
[0065]取木薯酒糟、猪粪、草木灰、麦麸按4:3:1.2:0.5 (重量比)混合，使发酵堆高度为
1.8米，每天多点检测发酵温度。根据温度变化，接种相当于初始物料干重0.2%的各发酵液，接种前分别用适量玉米面吸附各发酵种子液，接种后通过搅拌使混合均匀。各菌的接种时间为:当发酵最高温度达到55°C时接种UTM501、UTM601,当发酵最高温度达到65°C时接种UTM01、UTM02和UTM03，当发酵最高温度达到70°C时接种UTM801，并在70°C维持2天后；当发酵最高温度降至45°C时接种UTM401，每隔3天翻堆一次直至温度下降稳定于环境温度，将物料风干至含水率降至40%以下。
[0066]将风干物料过筛，然后添加助料:氯化亚铁(0.12%)、硫酸镁(0.03%)、硝酸钠(0.02%)、石灰(0.15%)。混合均匀后即为本发明堆肥接种用UTM发酵激活剂。经检测发酵激活剂的总活菌数为2.4X 108个/g。
[0067]实施例6发酵激活剂的应用效果
[0068]选用鸡粪为主要原料，糠醛和糖渣为辅料，按进行堆肥，将实施例3中的发酵激活剂 (记为激活剂3)按5%添加至物料中混合均匀。另分别以市场购买的发酵剂产品(宜春强微生物科技有限公司活力99堆肥快速腐熟剂，接种量按产品说明)和不添加发酵激活剂为空白对照，进行堆肥发酵。每5天搅拌，堆肥时间为30天。实验数据如下图1所示。发酵后第1天，激活剂3处理即达到59°C，而发酵剂产品和空白对照处理在第2天才达到53.7V和50°C，接种激活剂3起温明显要快于其他两个处理。
[0069]对高温阶段(≤50°C)的温度进行分析如下表1所示:
[0070]表1高温阶段的温度分析
[0071]
【权利要求】
1.一种复合微生物激活剂，包括以下A和B两组微生物菌剂制成:A 组:甲基营养型芽抱杆菌(Bacillus methylotrophicus) UTM401CGMCC N0.5927,厌氧芽抱杆菌(Anoxybacillus mongoliensis) UTM501CGMCC N0.5928,厌氧芽抱杆菌(Anoxybacillus pushchinoensis) UTM601CGMCC N0.5929,极端嗜热菌(Calditerricolayamamurae) UTM801CGMCC N0.6185 中的一种或几种；B 组:地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)UTM01CGMCC N0.5641，地芽孢杆菌(Geobacillussp.) UTM02CGMCC N0.5642，芽孢杆菌(Bacillus sp.) UTM03CGMCC N0.5643 中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的复合微生物激活剂，其特征在于，还包括助料，所述助料为氯化亚铁、硫酸镁、硝酸钠和石灰，其中氯化亚铁:硫酸镁:硝酸钠:石灰重量比为0.05~0.15:0.01 ~0.03:0.02 ~0.05:0.05 ~0.15。
3.权利要求1或2所述复合微生物激活剂的制备方法，包括以下步骤:(1)菌种的活化:将菌株斜面转接至活化培养基平板上，培养至丰厚；(2)发酵种子液制备:将步骤(1)中的菌种扩大培养；(3)发酵激活剂制备:选择主料与辅料及调理剂混合，然后分别接种步骤(2)中的发酵种子液，将物料风干过筛后添加助料。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)中菌种的活化和步骤(2)中菌种扩大培养的温度是:UTM40125 ~40°C ；UTM50150 ~60°C ；UTM60150 ~60°C ;UTM01、UTM02 和 UTM0360 ~70°C` ；UTM80170 ~80°C。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)中所述主料为木薯加工废弃物，所述辅料为猪粪和草木灰，所述调理剂为玉米面或麦麸；木薯加工废弃物、猪粪、草木灰、玉米面/麦麸的重量比是:3~4:1~3:0.8~1.2:0.2~0.5。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)中所述发酵种子液的接种量为物料干重的0.2%~0.5%。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)中所述助料添加至物料干重的重量比为:氯化亚铁0.08%~0.12%、硫酸镁0.01%~0.03%、硝酸钠0.02%~0.04%、石灰0.05% ~0.15%。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)中当发酵温度达到50~60°C时接种UTM501、UTM601 ;当发酵温度达到65°C时接种UTM01、UTM02、UTM03中的一种或几种；当发酵温度达到70°C时接种UTM801 ;发酵温度降至38~45°C时接种UTM401。
9.权利要求1-2任一项所述复合微生物激活剂在堆肥中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述复合微生物激活剂按重量比2~5%添加至堆肥中。
【文档编号】C12N1/20GK103695338SQ201310667581
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2012年12月26日
【发明者】刘永跃, 周顺桂, 许宜北, 汪涌 申请人:大地绿源环保科技(北京)有限公司