一种白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的方法
【专利摘要】一种白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的方法，包括以下步骤：（1）内生真菌L1孢子悬浮液制备；（2）培养基准备；（3）发酵。本发明工艺发酵条件简单，易控制，酶转化专一性强，转化率高，成本低，对环境友好。
【专利说明】一种白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的方法，尤其是涉及一种利用微生物法将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的方法。
【背景技术】
[0002]白藜芦醇是一种天然活性多酚化合物，具有抑制肿瘤、保护心血管、抗氧化、抗自由基等多种药理作用，被列为抗心血管病、抗癌最有前途的药物之一。
[0003]目前，制备白藜芦醇的方法主要包括:1.植物提取法，转化率低，成本高。2.化学合成法，合成步骤繁多，白藜芦醇极易被氧化，反应产率受限制；合成过程所用的许多催化剂和化学试剂都具有一定危害性，环境污染严重。3.植物细胞培养法，高产细胞株的遗传性状不稳 定等原因，难以迅速实现大规模工业化生产。由此可见，上述方法各有利弊。寻找一种转化率高，成本低的白藜芦醇制取方法，已成为目前白藜芦醇生产行业的当务之急O
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种转化率高，成本低的白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的方法。
[0005]本发明解决其技术问题采用的技术方案是:一种白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的方法，包括以下步骤:
Cl)内生真菌LI孢子悬浮液制备:从内生真菌LI PDA斜面上挑五环菌体于IOml生理盐水中，充分震荡；
所述内生真菌LI保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4558 (参见申请号为201110130127.1的专利申请文件)；
(2)培养基准备:将新鲜虎杖粉碎至200目，按质量比虎杖1.5wt%、无水乙醇2 wt%、CMC-Na 2.5 wt%、NH4NO3 0.2 wt%、Na2HPO40.06 wt%、CaCl20.1 wt% 配制发酵培养基，调起始 pH 值为 4.5 — 5.5 ;
(3)发酵:先将步骤(2)中的培养基经121°C、30min湿热灭菌；再将内生真菌LI孢子悬浮液，接入起始pH 4.5 — 5.5的培养基中，接种量为相当于培养基体积的5 - 10% (优选9%)，在250ml三角瓶中，培养基的装液量为30mL，在培养条件为温度26 — 30°C、转速200 — 220r/min 下，发酵 36 — 60h,即成。
[0006]HPLC检测发酵液中白藜芦醇苷和白藜芦醇含量，转化率> 60%,转化后发酵液中白藜芦醇含量≥30 u g/mL。
[0007]本发明之微生物法转化白藜芦醇苷为白藜芦醇，先从新鲜虎杖上分离、纯化出内生真菌LI，然后根据LI的生长性质特点，配制特定的培养基，在一定培养条件下通过LI转化虎杖白藜芦醇苷为白藜芦醇，确保白藜芦醇的高含量，进而提高白藜芦醇的产量。白藜芦醇苷就是虎杖的组成成分，传统提取只能提取虎杖中的白藜芦醇不能提取白藜芦醇苷，本发明就是通过转化虎杖中的白藜芦醇苷为白藜芦醇，进而提高产量。
[0008]本发明工艺发酵条件简单，易控制，酶转化专一性强，转化率高，成本低，对环境友好，是生产制备天然白藜芦醇的最好途径之一；且可实现工业化生产，环境污染小，资源环境友好，是生产天然白藜声醇高值开发利用的重要途径。
【具体实施方式】
[0009]以下结合实施例对本发明作进一步说明。
[0010]实施例1
本实施例包括以下步骤:
(1)内生真菌LI孢子悬浮液制备:从内生真菌LIPDA斜面上挑五环菌体于IOml生理盐水中，充分震荡；
所述内生真菌LI保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4558 (参见申请号为201110130127.1的专利申请文件)；
(2)培养基准备:将新鲜虎杖粉碎至200目，取200目新鲜虎杖粉末0.45g(虎杖
1.5wt%)、无水乙醇 0.6g (2%)、CMC-Na0.75g (2.5%)、NH4NO30.06g (0.2%)、Na2HPO40.018g(0.06%)、CaCl20.03g (0.1%)配制成发酵培养基；调起始pH为5.5 ;
(3)发酵:先将步骤(2)中的培养基经121°C、30min湿热灭菌；再将2.7ml的内生真菌LI孢子悬浮液接入250ml三角瓶中，所述三角瓶中装有30mL起始pH 5.5的培养基，再在培养条件为温度28°C、转速220r/min下，发酵60h，即成。
[0011]HPLC检测发酵液中白藜芦醇苷`和白藜芦醇含量，得白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的转化率为95.6%，转化后发酵液中白藜芦醇含量达52.533 u g/mL,为未发酵的9.90倍。
[0012]实施例2
本实施例包括以下步骤:
Cl)内生真菌LI孢子悬浮液制备:从内生真菌LI PDA斜面上挑五环菌体于IOml生理盐水中，充分震荡；
所述内生真菌LI保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4558 (参见申请号为201110130127.1的专利申请文件)；
(2)培养基准备:取200目新鲜虎杖粉末0.45g (虎杖1.5%)、无水乙醇0.6g (2%)、CMC-Na0.75g (2.5%),NH4NO30.06g (0.2%),Na2HPO40.018g (0.06%)、CaCl20.03g (0.1%)配制成发酵培养基；调起始PH为4.5 ;
(3)发酵:先将步骤(2)中的培养基经121°C、30min湿热灭菌；再将1.4ml的内生真菌LI孢子悬浮液接入250ml三角瓶中，所述250ml三角瓶中装有20mL起始pH 4.5培养基的250ml三角瓶中，再在培养条件为温度26°C、转速200r/min下，发酵36h即成。
[0013]HPLC检测发酵液中白藜芦醇苷和白藜芦醇含量，得白藜芦醇苷转化为白藜芦醇转化率为60.2%,转化后发酵液中白藜芦醇含量达33.080 u g/mL,为未发酵的6.23倍。
[0014]实施例3
本实施例包括以下步骤:
Cl)内生真菌LI孢子悬浮液制备:从内生真菌LI PDA斜面上挑五环菌体于IOml生理盐水中，充分震荡；所述内生真菌L1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4558 (参见申请号为201110130127.1的专利申请文件)；
(2)培养基准备:取200目新鲜虎杖粉末0.45g(虎杖1.5%)、无水乙醇0.6g (2%)、CMC-Na0.75g (2.5%),NH4NO30.06g (0.2%),Na2HPO40.018g (0.06%)、CaCl20.03g (0.1%)配制成发酵培养基；调起始PH为5.0 ;
(3)发酵:先将步骤(2)中的培养基经121°C、30min湿热灭菌；再将3.6ml的内生真菌LI孢子悬浮液接入装有40mL起始pH 5.0培养基的250ml三角瓶中，再在培养条件为温度28°C、转速200r/min下，发酵48h，即成。
[0015]HPLC检测发酵液中白藜芦醇苷和白藜芦醇含量，得白藜芦醇苷转化为白藜芦醇转化率为77.8%,转化后发酵液中白藜芦醇含量达42.752 u g/mL,为未发酵的8.06倍。
[0016]实施例4
本实施例包括以下步骤:
(l)内生真菌LI孢子悬浮液制备:从内生真菌L1 PDA斜面上挑五环菌体于IOml生理盐水中，充分震荡；
所述内生真菌LI保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4558 (参见申请号为201110130127.1的专利申请文件)；
(2)培养基准备:取200目新鲜虎杖粉末0.45g (虎杖1.5%)、无水乙醇0.6g (2%)、CMC-Na0.75g (2.5%),NH4NO30.06g (0.2%),Na2HPO40.018g (0.06%)、CaCl20.03g (0.1%)配制成发酵培养基；调起始PH为4.5 ;
(3)发酵:先将步骤(2)中的培养基经121°C、30min湿热灭菌；再将2.7ml的内生真菌L1孢子悬浮液接入装有30mL起始pH 4.5培养基的250ml三角瓶中，再在培养条件为温度30°C、转速200r/min下，发酵60h，即成。
[0017]HPLC检测发酵液中白藜芦醇苷和白藜芦醇含量，得白藜芦醇苷转化为白藜芦醇转化率为76.2%,转化后发酵液中白藜芦醇含量达41.873 u g/mL,为未发酵的7.89倍。
【权利要求】
1.一种白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)内生真菌LI孢子悬浮液制备:从内生真菌LIPDA斜面上挑五环菌体于IOml生理盐水中，充分震荡； 所述内生真菌LI保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC N0.4558 ； (2)培养基准备:将新鲜虎杖粉碎至200目，按质量比虎杖1.5wt%、无水乙醇2 wt%、CMC-Na 2.5 wt%、NH4NO3 0.2 wt%、Na2HPO40.06 wt%、CaCl20.1 wt% 配制发酵培养基，调起始 pH 为 4.5 — 5.5 ; (3)发酵:先将步骤(2)中的培养基经121°C、30min湿热灭菌；再将内生真菌LI孢子悬浮液，接入起始PH 4.5 - 5.5的培养基中，接种量为相当于培养基体积的5 — 10%，在250ml三角瓶中，培养基的装液量为30mL，在培养条件为温度26 — 30°C、转速200 —220r/min 下，发酵 36 — 60h,即成。
2.根据权利要求1所述的白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的方法，其特征在于，步骤(3)中，内生真菌LI孢 子悬浮液的接种量为相当于培养基体积的9%。
【文档编号】C12P7/22GK103695478SQ201310720687
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】刘杉林 申请人:湖南科源生物制品有限公司