一种高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D及其基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及一种高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示。本发明的甘露聚糖酶具有以下性质：最适pH为5.0，在pH3.5-8.0范围内，该酶能够维持其60%以上的酶活力，最适反应温度为65℃，并在50℃下非常稳定，另外，其比活力为3133U?mg–1。该甘露聚糖酶具有酸性、高比活、较好的耐热性，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的甘露聚糖酶。
【专利说明】一种高比活酸性β -甘露聚糖酶Man5D及其基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D及其基因和应用。
【背景技术】
[0002]植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质构成。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是由β_1，4-?-甘露糖连接而成的线状多聚体，在多糖的侧链上主要有葡萄糖基、乙酰基和半乳糖基等取代基团。β -甘露聚糖酶(β -mannanase EC3.2.1.78)是一种水解甘露聚糖的内切水解酶，以内切方式降解甘露糖主链β -1, 4糖苷键，释放出短的β_1，4甘露寡糖。
[0003]近年来，随着甘露寡糖生理功能的发现，绿色饲料的兴起以及人们环保意识的增强，能源的再生利用研究，人们对β -甘露聚糖酶的研究和利用已进入了一个新的阶段。
甘露聚糖酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。
[0004]甘露聚糖酶广泛存在于细菌、放线菌、真菌、植物、动物等生物中。细菌来源的甘露聚糖酶主要是酸偏中性的甘露聚糖酶。其分子量多在35kDa~55kDa之间，最适反应作用温度为50°C~70°C。目前研究最多的是芽孢杆菌，除嗜碱性芽孢杆菌的最适作用PH达到 pH9.0以上，大多最适反应pH在5.5~8.0之间。真菌的β -甘露聚糖酶一般呈酸性，分子量大约在45kDa~55kDa，最适作用pH为4.0~6.0，最适作用温度为55°C~75°C。相对细菌而言，真菌来源的甘露聚糖酶最适反应pH值、pH稳定性都偏低，耐热性比细菌差。目前国内外，虽然许多β`_甘露聚糖酶被克隆分离及性质测定，但这些酶的性质特征，均存在一些缺陷，例如，PH作用范围不合适，热稳定性差，表达量低等，均不能满足实际应用的需要。因此人们希望能够找到一种新的能够满足实际应用需求的β_甘露聚糖酶，从而能够进一步推广该β-甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等行业中应用。
[0005]本发明从Staphylotrichum coccosporum NBRC31817 菌株中得到了一个新的β_甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶具有以下几个优点:酸性、较好的热稳定性、高比活、强的蛋白酶抗性、容易发酵生产。所有这些优点都意味着新发明的β_甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等行业中，将会更有应用价值比以前所报道的β_甘露聚糖酶。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种酸性、较好热稳定性、高比活的β -甘露聚糖酶。
[0007]本发明的再一目的是提供上述β_甘露聚糖酶的基因。
[0008]本发明的再一目的是提供包含上述β -甘露聚糖酶的重组载体。
[0009]本发明的再一目的是提供包含上述甘露聚糖酶基因的重组菌株。
[0010]本发明的再一目的是提供一种制备β_甘露聚糖酶的方法。
[0011]本发明的再一目的是提供上述β_甘露聚糖酶的应用。[0012]本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的甘露聚糖酶。该甘露聚糖酶Man?，其氣基酸序列如SEQ ID N0.1:
[0013]
【权利要求】
1.一种高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1或 SEQ ID N0.2 所示。
2.一种高比活酸性β_甘露聚糖酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的一种高比活酸性β -甘露聚糖酶Man?。
3.根据权利要求2所述的高比活酸性β-甘露聚糖酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 或 SEQ ID N0.5 所示。
4.包含权利要求2所述高比活酸性β_甘露聚糖酶基因的重组表达载体。
5.包含权利要求2所述高比活酸性β-甘露聚糖酶基因的重组表达载体pPIC9_man5D。
6.包含权利要求2所述高比活酸性β_甘露聚糖酶基因的重组菌株。
7.包含权利要求2所述高比活酸性β-甘露聚糖酶基因的重组菌株GS115/manro。
8.一种制备高比活酸性β_甘露聚糖酶Man?的方法，其特征在于，包括以下步骤: (O以权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞； (2)培养宿主细胞； (3)分离纯化获得β-甘露聚糖酶Man?。
9.权利要求1所述高比活酸性β-甘露聚糖酶Man?的应用。
【文档编号】C12N1/19GK103642779SQ201310733016
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】姚斌, 罗会颖, 王彩虹, 石鹏君, 黄火清, 王亚茹, 杨培龙, 柏映国, 孟昆 申请人:中国农业科学院饲料研究所