提取和储存核酸的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本公开总体上涉及用于长期在环境条件下以干燥形式提取、稳定和储存核酸(特别是RNA)的固体基质。也描述了从固体组合物提取、收集和回收核酸的方法。
【专利说明】提取和储存核酸的方法和组合物 发明领域
[0001] 本公开总体上涉及用于以干燥形式从生物样品环境提取、稳定和保存核酸的固体 组合物。本公开也描述从固体组合物提取、收集、保存和回收核酸的方法。
[0002] 发明背景 由于化学自水解和酶介导的降解两者，RNA是最不稳定的生物分子之一。因此，提取和 保存从生物样品得到的RNA易受多种环境因素影响，包括但不限于用于提取或收集RNA的 缓冲剂、pH、温度，特别是强力（robust)核糖核酸酶（RNases)的普遍存在。因此，纯化和未 纯化状态的RNA -般都需要在-80°C储存，以防止水解和酶降解，并保持RNA样品的完整性。 为了避免与_80°C冷冻相关的成本和空间要求，在环境条件下提取、收集和保存RNA的能力 在经济上合乎需要。
[0003] 目前在环境条件下以液态保存RNA的方法集中在RNA酶（RNases)的失活，例如， 通过使用去污剂、离液化合物（chaotropic compound)、还原剂、过渡金属、有机溶剂、螯合 齐U、蛋白酶、RNA酶肽抑制剂和抗RNA酶抗体。另外的努力已集中在使RNA化学修饰，以防 止酯交换和自水解。但很多市售RNA保存产品仅可在室温保存RNA数天或数星期。声称以 干燥形式成功收集和保存RNA的目前技术一般需要在储存RNA之前首先使RNA从生物材料 (例如，生物样品，如血液、血清、组织、唾液等）"预纯化"并浓缩。
[0004] 以干燥形式保存RNA的目前技术还需要另外的干燥设备。因此，这些方法无助于 在不进行显著样品处理的情况下从样品（例如，生物样品）直接收集RNA。
[0005] 因此，本领域期需且需要将从样品（例如，生物样品）提取、稳定和储存/保存RNA 整合在单一过程内的组合物和方法。这些组合物和方法允许在环境条件下长期储存RNA，并 允许回收完整的RNA用于进一步分析。
【发明内容】
[0006] 描述了从样品（例如，下文限定的生物样品）提取和储存核酸的固体基质，其中包 含蛋白变性剂、还原剂和缓冲剂的组合物在固体基质中以干燥形式存在。本申请的固体基 质允许在环境条件下以干燥形式长期储存RNA和DNA。可使以干燥形式包含核酸（例如， RNA)的固体基质经过一个过程，从而以适用于进一步分析所收集的核酸样品的完整形式从 固体基质释放核酸。也提供了用本发明的固体基质从生物样品提取和储存核酸的方法。
[0007] 附图简述 在参考附图阅读以下详述时，化学改性的多孔薄膜的这些和其他特征、方面和优点将 变得更好理解，其中在全部附图中相同的符号代表相同的元件，其中： 图1提供在将培养的人细胞点样到不同组成的固体基质后用电洗脱从纤维素回收的 核酸的代表性电泳图。指出了高分子量基因组DNA和28s/18s rRNA带。还提供了用Image J.的DNA和RNA的定量。在A组中从各泳道的顶部到底部划垂直线，并且用标绘分布函数 (Plot Profile function),将像素强度（灰度值任意单位）作为线距离（cm)的函数作图。 在框中显示相当于基因组DNA和28s/18s rRNA的峰。另外的试验细节阐明于以下实施例 部分。
[0008] 图2提供各描述的组合物的28s和18s rRNA的凝胶像素强度，显示为灰度值任意 单位。分析前，纤维素样品在干燥箱中在室温储存10天。28s与18s rRNA之比在图上的各 条上阐明。另外的试验细节阐明于以下实施例部分。
[0009] 图3提供各描述的组合物的28s和18s rRNA的凝胶像素强度。分析前，纤维素样 品在干燥箱中在室温储存13天。各试验条件的28s与18s rRNA之比在图上的各条上显现。 另外的试验细节阐明于以下实施例部分。
[0010] 图4提供各描述的组合物的28s和18s rRNA的凝胶像素强度。分析前，纤维素样 品在干燥箱中在室温储存10天。各试验条件的28s与18s rRNA之比在图上的各条上显现。 另外的试验细节阐明于以下实施例部分。
[0011] 图5提供所示各组合物的28s和18s rRNA条带的凝胶像素强度。分析前，纤维素 样品在干燥箱中在室温储存30天。各试验条件的28s与18s rRNA之比在图上的各条上显 现。另外的试验细节阐明于以下实施例部分。
[0012] 图6提供对于所列各条件从纤维素纸上的经干燥血斑（blood spot)检测的RNA 完整性计数（RIN)，这用 RNA 6000 Pico LabChips在 Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析 仪上测定。另外的试验细节阐明于以下实施例部分。
[0013] 图7提供了在纤维素纸上抗日光破坏的mRNA保护的证据。图形中的各条表示包 含图中所示组合物的UV处理和未处理样品之间的qRT-PCR循环阈的差异。另外的试验细 节阐明于以下实施例部分。
[0014] 图8提供在不同缓冲剂存在下在不同温度经4星期时间在纤维素基纸上的TCEP 活性。另外的细节提供于实施例部分。
[0015] 发明详述 本文描述从样品（例如，生物样品）提取并储存核酸（例如，RNA、DNA或其组合）的固 体基质，其中包含蛋白变性剂、还原剂和缓冲剂的组合物在固体基质中以干燥状态存在。本 发明的组合物允许在环境储存条件下长期干燥保存核酸。关于RNA的环境保存（众所周知 其是不稳定的），这一观察结果特别重要。本文所用术语"固体基质"包括但不限于纤维素 基产品、纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维或其任何组合。本申请的固体基质可以是多孔的。在 具体实施方案中，固体基质为来自Whatman?的多孔纤维素纸，例如FTA?或FTA? Elute。 术语"提取"指从样品（更具体地讲，生物样品）分离和分开核酸的任何方法。例如，核酸， 如RNA和DNA，可在空气中蒸发性的样品细胞裂解期间释放，或者通过存在于化学改性固体 基质（例如FTA? Elute纤维素纸）中的化合物（其与样品接触时引起细胞裂解并释放核 酸）释放。本领域的技术人员应了解，可在公开的组合物和方法中使用使得从样品（例如， 未纯化生物样品）提取核酸（特别是RNA)的任何方法，从而核酸能够俘获在固体基质上用 于稳定和保存核酸。从样品提取核酸的方法的以上实例只为了说明目的提供。在本文中， 对于以适用于进一步分析的形式保持经提取核酸，术语"储存"或"保存"可互换使用。
[0016] 核酸（特别是RNA)领域的技术人员传统上根据下列评价RNA的稳定性和品质： (l)mRNA靶的定量RT-PCR扩增；（2)在Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析仪上的RNA完 整性计数（RIN)分析；和（3) 28s: 18s核糖体RNA (rRNA)之比，这兼顾（compromise)总细胞 RNA的整体。高品质细胞RNA -般显示大于1的28s: 18s rRNA比，并且RIN评分接近10。 另外，高品质细胞RNA支持低丰度和大的（例如，大于lkB) mRNA二者的有效扩增。为了方 便的目的，rRNA信号强度和28s: 18s rRNA之比通常用于通过凝胶电泳快速筛选并识别具 有强的RNA储存性质的样品。
[0017] 本文限定的"生物样品"包括但不限于从任何生物体（包括人）得到的血液、血清、 组织和唾液。生物样品可由经过自诊断检验（例如，血糖监测）的个人得到，或者由受过训 练的医学专业人员通过多种技术得到，包括例如用针抽吸血液，或者刮或擦患者皮肤上的 特定区域，例如损伤处。收集各种生物样品的方法在本领域熟知。术语"样品"不仅包括以 上限定的生物样品，而且还包括例如组织培养细胞和纯化的核酸。
[0018] 包含蛋白变性剂、还原剂和缓冲剂的组合物存在于本公开的干燥固体基质中。组 合物可包含一种或多种各以上所列组分。组合物可任选进一步包含紫外（UV)抑制剂、自由 基捕集剂、RNA酶抑制剂、螯合剂或其任何组合。本领域的技术人员应了解，多种蛋白变性剂 在本领域已知，并且可经验性地选择用于本文所述的组合物和方法。并非旨在受限于具体 的蛋白变性剂，示例性蛋白变性剂包括硫氰酸胍、盐酸胍、精氨酸、十二烷基硫酸钠（SDS)、 脲或其任何组合。示例性蛋白变性剂的示意图如下所示：
【权利要求】
1. 一种用于从样品提取和储存核酸的固体基质，其中包含至少一种蛋白变性剂、至少 一种还原剂和缓冲剂的组合物在固体基质中以干燥状态存在。
2. 权利要求1的固体基质，其中所述样品为生物样品。
3. 权利要求1的固体基质，其中在固体基质中存在的组合物进一步包含UV抑制剂、自 由基捕集剂、螯合剂或其任何组合。
4. 权利要求1的固体基质，其中在固体基质中存在的组合物进一步包含RNA酶抑制 剂。
5. 权利要求1的固体基质，其中所述固体基质允许在环境条件下以干燥形式长期储 存核酸。
6. 权利要求5的固体基质，其中所述核酸为RNA、DNA或其组合。
7. 权利要求6的固体基质，其中所述核酸为RNA。
8. 权利要求1的固体基质，其中所述固体基质为包含纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维 或其任何组合的多孔基质。
9. 权利要求8的固体基质，其中所述多孔基质为纤维素纸。
10. 权利要求1的固体基质，其中所述蛋白变性剂选自盐酸胍、硫氰酸胍（GITC)、精氨 酸、十二烷基硫酸钠（SDS)、脲及其任何组合。
11. 权利要求1的固体基质，其中所述还原剂选自二硫苏糖醇（DTT)、2-巯基乙醇 (2-ME)、三（2-羧基乙基）膦（TCEP)及其组合。
12. 权利要求1的固体基质，其中所述缓冲剂选自2-氨基-2-羟基甲基-丙-1，3-二 醇（1'1^)、2-(^吗啉代）乙磺酸（1^5)、3-(^吗啉代）丙磺酸（厘(^5)、4-(2-羟基乙 基）-1_哌嗪乙磺酸（HEPES)、柠檬酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。
13. 权利要求12的固体基质，其中所述缓冲剂具有3-8之间的pH。
14. 权利要求3的固体基质，其中UV防护剂或自由基捕集剂选自氢醌单甲醚（MEHQ)、 氢醌（HQ)、甲基氢醌（THQ)和抗坏血酸。
15. 权利要求4的固体基质，其中所述RNA酶抑制剂为氧钒核糖核苷复合物（VRC)、核 苷酸类似物或市售RNA酶抑制剂。
16. 权利要求1的固体基质，其中所述固体基质为基于多孔纤维素的基质，并且 a) 所述蛋白变性剂为GITC、去污剂或其组合； b) 所述还原剂为DTT、TCEP或其组合；并且 c) 所述缓冲剂为Tris、MES或MOPS。
17. 权利要求16的固体基质，所述固体基质进一步包含自由基捕集剂，其中自由基捕 集剂包括MEHQ、HQ、THQ或抗坏血酸。
18. -种从样品提取和储存核酸的方法，所述方法包括： a) 提供固体基质，其中包含至少一种蛋白变性剂、至少一种还原剂、缓冲剂和任选的 自由基捕集剂的组合物在固体基质中以干燥状态存在； b) 将样品施加到固体基质，以收集核酸； c) 使固体基质干燥；并且 d) 在环境条件下以干燥状态在固体基质上储存核酸。
19. 权利要求18的方法，其中所述方法进一步包括从固体基质回收核酸。
20. 权利要求18的方法，其中所述样品为生物样品。
21. 权利要求20的方法，其中所述生物样品为血液、血清、组织、唾液或细胞。
22. 权利要求18的方法，其中所述样品为纯化的核酸样品或组织培养细胞制品。
23. 权利要求18的方法，其中不需要为了稳定和保存核酸而在样品施加到固体基质 之前从样品纯化核酸。
24. 权利要求18的方法，其中所述方法允许在环境条件下以干燥形式长期储存RNA。
25. 权利要求19的方法，其中通过使基质在水溶液、缓冲剂或有机溶液中重新水合而 从固体基质回收核酸，并且其中使核酸经过进一步分析。
26. 权利要求19的方法，其中核酸通过电洗脱从固体基质回收。
【文档编号】C12N5/00GK104254776SQ201380022584
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年4月29日 优先权日:2012年4月30日
【发明者】李兵, D.R.穆尔, E.L.克瓦姆 申请人:通用电气公司