多能干细胞的培养方法及该方法中使用的多肽的制作方法

多能干细胞的培养方法及该方法中使用的多肽的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种由40个～450个氨基酸残基构成的多肽，其含有：(1)含有选自CSYYQSC(序列号1)表示的氨基酸序列及RGD表示的氨基酸序列中的至少一个的第1区域；及(2)含有(2-i)PRPSLAKKQRFRHRN RKGYRSQRGHSRGRNQN(序列号2)表示的氨基酸序列、(2-ii)与序列号2表示的氨基酸序列具有50％以上的同源性且具有对培养器的吸附能力的氨基酸序列、或(2-iii)相对于序列号2表示的氨基酸序列附加、替换或缺失了1个～30个氨基酸残基且具有对培养器的吸附能力的氨基酸序列的第2区域。
【专利说明】多能干细胞的培养方法及该方法中使用的多肽

【技术领域】
[0001] 本发明涉及多能干细胞的培养方法及该方法中使用的多肽。

【背景技术】
[0002] 以损伤组织的功能恢复等为目的，开发了各种再生医疗。其中，报告了大量关于以 组织本身的再生等为最终目的的灵长类、特别是人类的全能或多能干细胞的技术。特别是， 诱导型多能干细胞（iPS细胞）由于与胚胎干细胞不同地由体细胞诱导，因此具有伦理方面 的问题少的优点。
[0003] 对这些灵长类的全能或多能干细胞（对这两者进行统称，在本发明中仅称作"多 能干细胞"）进行培养时，要求以未分化状态长期地进行维持。为了对未分化状态的多能干 细胞进行长期间培养，一般来说使用小鼠成纤维细胞等饲养细胞（feeder cell)。
[0004] 但是，在使用上述小鼠成纤维细胞等异种动物来源的饲养细胞时，被指出有异种 动物来源的抗原性物质等异物混入到培养液中的可能性，当将全能或多能干细胞在医疗用 途或者基于其的用途中使用时，要求在不存在饲养细胞的情况下对这些细胞进行培养。
[0005] 鉴于这种情况，进行了代替饲养细胞的功能的细胞粘附性材料的开发。例如，在 Nature Biotechnology, 2001，Vol 19, PP. 971-974中公开了作为饲养细胞的代替物，使用 作为小鼠肉瘤提取成分的基质胶，始终良好地对维持了未分化状态的人胚胎干细胞进行培 养。
[0006] 日本特开2001-17183号公报中公开了不含饲养细胞且含有进行增殖的灵长类原 始细胞的细胞性组合物，并作为优选的方式公开了进一步含有细胞外基质的细胞性组合 物。另外，日本特开2010-29186号公报中公开了利用含有规定浓度的细胞外基质蛋白和水 性溶剂的包覆溶液，对经等离子体聚合的细胞培养表面进一步进行包覆而得到的细胞培养 基质，并记载了利用该细胞培养基质，具有对于避免胚胎干细胞的分化而言效果良好的粘 附性。此外，日本特表2012-502664公报中公开了与糖胺聚糖（GAG)结合的肽。
[0007] Biomaterials, 2010,Nov ;Vol. 31(32)，PP. 8281-8218及Nature Biotechn ology， 2010, Vol. 28, No. 6, pp. 606-610中分别公开了由可有助于胚胎干细胞的长期培养的玻连蛋 白部分序列构成的重组肽或合成肽，具体地为天然玻连蛋白的第1个?第52个氨基酸序列 (参照 Biomaterials, 2010, Nov ;Vol. 31 (32)，pp. 8281-8218)及含有 RGD 序列的第 41 个? 第 52 个的氛基酸序列（Nature Biotechnology, 2010, Vol. 28, No. 6, pp. 606-610)。已知由 于这些肽是非生物体试样，因此在能够避免抗原性物质等的混入可能性、且可工业上进行 生产的方面优异。


【发明内容】

[0008] 发明欲解决的课题
[0009] 但是，考虑到将多能干细胞在再生医疗等医疗用途或者基于其的用途中使用时， 应该尽量排除使用以小鼠等来源的成纤维细胞等异种的饲养细胞及小鼠来源的基质胶为 代表的异种动物来源成分。另外，即使是同种动物来源的细胞或成分，也无法完全地排除抗 原性物质混入等的可能性。此外，无论是同种及异种中的任一者，生物体来源的材料从提取 量极为微量、或随着供者不同而性能参差不齐等的工业观点出发，均不优选。近年来，为了 在医疗用途中进行应用，盛行在未混有异种动物来源成分或抗原性物质的经化学鉴定的条 件下进行干细胞培养的研究。但是，未发现足以实用的显示细胞培养性能的能够代替饲养 细胞的材料。
[0010] 例如，作为避免使用生物体来源的材料本身的手段,在Biomaterials, 2010, Nov ; Vol. 31(32)，PP. 8281-8218 及 Nature Biotechnology, 2010, Vol. 28, No. 6, PP. 606-610 中 公开了使用由人玻连蛋白的部分序列构成的重组肽或者合成肽来实施胚胎干细胞的长期 培养的例子。
[0011] 但是，这种肽由于对培养器的吸附性同样地低，因此需要对培养器进行使其化学 键合的工序。例如，Nature Biotechnology, 2010, Vol. 28, No. 6, PP. 606-610 中公开了在培 养器的细胞培养表面导入丙烯酸酯、使肽共价键合，但该方法无法自由地选择使肽键合的 培养表面，不仅通用性、简便性差，而且仅靠上述肽，作为用于培养胚胎干细胞（ESC)及诱 导性多能干细胞（iPS)的细胞培养性能可以说并不充分。此外，日本特表2012-502664公报 中公开了键合于糖胺聚糖（GAG)的肽，并记载了利用与糖胺聚糖键合的部位、在ESC及iPS 的长期培养和维持中进行使用。但是，仅靠对GAG的键合部位，对于用于培养ESC及iPS的 细胞培养性能可以说并不充分。
[0012] 因此，本发明的目的在于提供在能够使多能干细胞以未分化状态增殖的同时、不 需要利用化学键合对培养器进行固定处理而能够在工业上进行生产的多肽及使用了该多 肽的多能干细胞的培养方法。
[0013] 用于解决课题的手段
[0014] 本
【发明者】们为了开发在能够使多能干细胞以未分化状态增殖的同时，对培养器的 吸附性优异且不需要利用化学键合对培养器进行固定处理的重组蛋白，反复进行了深入研 究，结果发现，由含有特定的人玻连蛋白N末端部分序列且具有对培养器的吸附能力的氨 基酸残基构成的特定的多肽能够在不含异种动物来源成分的培养液中使多能干细胞长期 地维持未分化状态并增殖，且即使不介由化学键合也会吸附于培养器。此外还令人吃惊地 发现，由该序列构成的多肽与由人玻连蛋白全长序列构成的重组玻连蛋白相比在增殖性方 面显著性地优异，进而完成了本发明。
[0015] 本发明提供以下方式：
[0016] [1] 一种由40个?450个氨基酸残基构成的多肽，其含有：
[0017] (1)含有选自CSYYQSC (序列号1)表示的氨基酸序列及RGD表示的氨基酸序列中 的至少一个的第1区域；和
[0018] (2)含有（2-i)PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN(序列号 2)表示的氨基酸序 列、（2-ii)与序列号2表示的氨基酸序列具有50%以上的同源性且具有对培养器的吸附能 力的氨基酸序列、或（2-iii)相对于序列号2表示的氨基酸序列附加、替换或缺失了 1个? 30个氨基酸残基且具有对培养器的吸附能力的氨基酸序列的第2区域。
[0019] [2]根据上述[1]所述的多肽，其GRAVY值为一2.0?一0.95。
[0020] [3]根据上述[1]或[2]所述的多肽，其中，所述第1区域含有CSYYQSC(序列号 1)表示的氨基酸序列及RGD表示的氨基酸序列这两个。
[0021] [4]根据上述[1]?[3]中任一项所述的多肽，其由40个?400个氨基酸残基构 成。
[0022] [5]根据上述[1]?[4]中任一项所述的多肽，其进一步含有由下述（3-i)? (3-iii)中的任一个氨基酸序列构成的第3区域：（3-i)序列号3表示的氨基酸序列中， 由第56个?第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，（3-ii)与所 述（3-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有50 %以上的同源性的氨基酸序列，及 (3-iii)相对于所述（3-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列附加、替换或缺失了 1个? 30个氨基酸残基的氨基酸序列。
[0023] [6]根据上述[1]?[4]中任一项所述的多肽，其进一步含有由下述（3a_i)? (3a-iii)中的任一个氨基酸序列构成的第3区域：（3a-i)由第132个?第341个氨基酸残 基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，（3a_ii)与所述（3a_i)的氨基酸序列或其部分 氨基酸序列具有50%以上的同源性的氨基酸序列，及（3a_iii)相对于所述（3a_i)的氨基 酸序列或其部分氨基酸序列附加、替换或缺失了 1个?30个氨基酸残基的氨基酸序列。
[0024] [7]根据上述[1]?[4]中任一项所述的多肽，其进一步含有由下述（3b_i)? (3b-iii)中的任一个氨基酸序列构成的第3区域：（3b-i)由第269个?第341个氨基酸残 基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，（3b-ii)与所述（3b-i)的氨基酸序列或其部分 氨基酸序列具有50%以上的同源性的氨基酸序列，及（3b-iii)相对于所述（3b-i)的氨基 酸序列或其部分氨基酸序列附加、替换或缺失了 1个?30个氨基酸残基的氨基酸序列。
[0025] [8]根据上述[1]?[7]中任一项所述的多肽，其进一步含有由下述（4-i)? (4-iii)中的任一个氨基酸序列构成的第4区域：(4-i)在序列号3表示的氨基酸序列 中，由第374个?第459个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，（4-ii)与 所述（4-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有50%以上的同源性的氨基酸序列，及 (4-iii)相对于所述（4-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列附加、替换或缺失了 1个? 30个氨基酸残基的氨基酸序列。
[0026] [9]根据上述[1]?[8]中任一项所述的多肽，其中，所述（2-ii)的氨基酸序列相 对于序列号2表不的氨基酸序列的同源性为80%以上。
[0027] [10]根据上述[1]?[8]中任一项所述的多肽，其中，所述（2-iii)氨基酸序列相 对于序列号2表示的氨基酸序列附加、替换或缺失的氨基酸残基数为1?15。
[0028] [11] 一种由80个?450个氨基酸残基构成的多肽，其含有：
[0029] (1)由下述氨基酸序列构成的第1区域，所述氨基酸序列由序列号3表示的氨基酸 序列的第25个?第47个氨基酸残基构成，
[0030] (2)由下述氨基酸序列构成的第2区域，所述氨基酸序列由序列号3表示的氨基酸 序列的第342个?第373个氨基酸残基构成，以及
[0031] 选自以下第3区域及第4区域中的至少1个：
[0032] (3)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第3区域，所述氨基酸序列由 序列号3表示的氨基酸序列的第269个?第341个氨基酸残基构成，及
[0033] (4)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第4区域，所述氨基酸序列由 序列号3表示的氨基酸序列的第374个?第459个氨基酸残基构成。
[0034] [12] -种由100个?450个氨基酸残基构成的多肽，其含有：
[0035] (1)由下述氨基酸序列构成的第1区域，所述氨基酸序列由序列号3表示的氨基酸 序列的第1个?第55个氨基酸残基构成，
[0036] (2)由下述氨基酸序列构成的第2区域，所述氨基酸序列由序列号3表示的氨基酸 序列的第342个?第373个氨基酸残基构成，以及
[0037] 选自以下第3区域及第4区域中的至少1个：
[0038] (3)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第3区域，所述氨基酸序列由 序列号3表示的氨基酸序列的第269个?第341个氨基酸残基构成，及
[0039] (4)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第4区域，所述氨基酸序列由 序列号3表示的氨基酸序列的第374个?第459个氨基酸残基构成。
[0040] [13]根据上述[11]或[12]所述的多肽，其GRAVY值为一2.0?一0.95。
[0041] [14]根据上述[1]?[13]中任一项所述的多肽，其中，氨基酸残基数为250个以 下。
[0042] [15]根据上述[5]?[14]中任一项所述的多肽，其中，所述多肽含有第3区域，所 述第3区域在对应于序列号3表示的氨基酸序列的半胱氨酸残基的位置上具有除半胱氨酸 残基以外的氨基酸残基。
[0043] [16]根据上述[5]?[14]中任一项所述的多肽，其中，所述多肽含有第3区域， 所述第3区域在对应于序列号3表示的氨基酸序列的半胱氨酸残基的位置上具有丝氨酸残 基、丙氨酸残基或甘氨酸残基。
[0044] [17]根据上述[1]?[16]中任一项所述的多肽，其中，所述第1区域位于所述第 2区域的N末端侧。
[0045] [18]根据上述[1]?[17]中任一项所述的多肽，其中，序列号1表示的氨基酸序 列中的2个半胱氨酸残基在两者间形成交联。
[0046] [19] -种多肽，其具有序列号4?序列号23、序列号38及序列号39中的任一个 表示的氨基酸序列。
[0047] [20] -种由40个?450个氨基酸残基构成的多肽，其（1)含有CSYYQSC (序列号 1)表示的氨基酸序列且具有对培养器的吸附能力。
[0048] [21]根据上述[20]所述的多肤，其进一步含有RGD表不的氣基酸序列。
[0049] [22]根据上述[20]或[21]所述的多肽，其GRAVY值为一2.0?一0.95。
[0050] [23] -种多能干细胞的培养方法，其包含：对支撑载体的细胞培养表面赋予上述 [1]?[22]中任一项所述的多肽，获得多肽包覆培养表面；以及在所述多肽包覆培养表面 上接种多能干细胞并进行培养。
[0051] [24]根据上述[23]所述的多能干细胞的培养方法，其中，所述多能干细胞为选自 胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、成体干细胞、受精卵内细胞集合细胞及早期胚胎细胞中的 至少一种。
[0052] [25]根据上述[23]或[24]所述的多能干细胞的培养方法，其中，所述多能干细胞 为诱导型多能干细胞。
[0053] [26]根据上述[23]?[25]中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其为在不存 在异种动物来源成分及血清来源成分的情况下对所述多能干细胞进行培养。
[0054] [27]根据上述[23]?[26]中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其中，所述多 肽在所述细胞培养表面上的赋予量为lpmol/cm 2?1000pmol/cm2。
[0055] [28] -种培养器，其具有：具有细胞培养表面的支撑载体、和配置于所述支撑载 体的细胞培养表面上的上述[1]?[22]中任一项所述的多肽。
[0056] 发明效果
[0057] 通过本发明，可以提供在能够使多能干细胞以未分化状态增殖的同时，不需要利 用化学键合对培养器进行固定处理而能够在工业上进行生产的多肽及使用了该多肽的多 能干细胞的培养方法。

【专利附图】

【附图说明】
[0058] 图1是表示本发明实施例中的各多肽的培养板表面的吸附试验结果的曲线图。
[0059] 图2是表示本发明实施例中的使用了各多肽的iPS细胞的增殖曲线的曲线图。
[0060] 图3是本发明实施例中的在各多肽上进行了培养时的iPS细胞集落的形态图像 (左栏）及放大图像（右栏）。
[0061] 图4是本发明实施例中的在各多肽上进行了培养时的iPS细胞的DAPI染色图像 (左栏）及NANOG染色图像（右栏）。

【具体实施方式】
[0062] 本发明的多肽是含有（1)CSYYQSC(序列号1)表不的氨基酸序列且具有对培养器 的吸附能力的由40个?450个氨基酸残基构成的多肽，或者含有下述第1区域和第2区域 的由40个?450个氨基酸残基构成的多肽：（1)含有CSYYQSC (序列号1)表示的氨基酸序 列及RGD表示的氨基酸序列中的至少一个的第1区域；及（2)含有（2-i)PRPSLAKKQRFRHRN RKGYRSQRGHSRGRNQN(序列号2)表示的氨基酸序列、（2-ii)与序列号2表示的氨基酸序列 具有50%以上的同源性且具有对培养器的吸附能力的氨基酸序列、或（2-iii)相对于序列 号2表示的氨基酸序列附加、替换或缺失了 1个?30个氨基酸残基且具有对培养器的吸附 能力的氨基酸序列的第2区域。以下，本说明书中有时将这些多肽称作"培养用多肽"。但 该多肽可以在除培养用以外的目的中使用。
[0063] 本发明中发现，本发明的所述培养用多肽中，由于含有特定氨基酸序列的第1区 域具有优异的细胞粘附性，因此可以使细胞、特别是多能干细胞良好地增殖。具有这样的氨 基酸序列的本发明的多肽能够使多能干细胞在维持未分化状态的同时长期地增殖。
[0064] 另外，本发明中发现，含有特定序列的第2区域有助于提高对培养器表面的吸附 性。具有这样的氨基酸序列的本发明的多肽显示对培养器的良好的粘附性，通过与所述第 1区域一起含有在多肽中，能够在培养期间中不会自培养器的细胞培养表面剥离的情况下， 使多能干细胞在维持未分化状态的同时长期地增殖。另外，本发明的多肽可以在抑制从培 养器的表面剥离的同时使培养中的未分化状态的多能干细胞增殖，可以提高培养操作中的 操作性。
[0065] 其结果，通过本发明，能够在促进多能干细胞在未分化状态下增殖的同时，能够不 需要利用化学键合对培养器进行固定处理地获得能够在工业上生产的多肽。
[0066] 另外，本发明的多肽与天然人玻连蛋白相比，在排除了抗原性物质、感染症源混入 的风险的同时，能够保持与天然玻连蛋白同等的性能，即对多能干细胞的粘附性、细胞增殖 性、未分化维持性。
[0067] 另一方面，在本发明的多肽的存在下（优选为不存在异种动物来源成分等的情况 下）进行培养的多能干细胞能够基本完全或大幅度地排除试样等来源的抗原性物质等异 物混入的可能性，对于将该培养方法培养的多能干细胞用于医疗用途或者基于其的用途来 说，能够充分地确保安全性。
[0068] 另外，通过使用了本发明多肽的培养方法，能够以更低成本且简单的操作对多能 干细胞进行培养，不仅对医疗用途而且对研究领域中的需求也具有巨大贡献。
[0069] 本说明书中，"工序"这一用语不仅包括独立的工序，即使是在无法与其他工序明 确地区分的情况下，只要可达成本工序所期待的目的，则也包含在本用语中。
[0070] 另外，本说明书中，使用"?"表示的数值范围表示将"?"前后所记载的数值分别 作为最小值及最大值并包含在内的范围。
[0071 ] 另外，本说明书中，关于组合物中各成分的量，当组合物中属于各成分的物质存在 多种时，只要无特别限定，则是指组合物中存在的该多种物质的总量。
[0072] 本说明书中，"同种"是指人，"异种"是指除人以外的动物。
[0073] 本说明书中，有时使用本【技术领域】中公知的单字母表述（例如将甘氨酸残基记为 "G"）或三字母表述（例如将甘氨酸残基记为"Gly"）来表示氨基酸序列中的氨基酸残基。 [0074] 本发明中，与多肽的氨基酸序列有关的" ％ "只要无特别限定，则是以氨基酸（或 亚氨基酸）残基的个数为基准。
[0075] 本说明书中，关于氨基酸序列的特定氨基酸残基所使用的"对应的氨基酸残基"等 表述是指在考虑采用该【技术领域】中公知的做法进行了插入、缺失及替换的基础上，按照相 同的氨基酸残基达到最多的方式将进行对比的2个以上的氨基酸序列排列（对齐）时，与 作为基准的氨基酸序列中的特定氨基酸残基的位置相一致的其他的氨基酸序列中的氨基 酸残基。
[0076] 本说明书中与氨基酸序列有关的"同源性"可以是指使用BLAST包（参照Ausubel 等，1999Short Protocols in Molecular Biology, 4thEd_Chapte r 18)计算的值。例如 相对于序列号2的同源性为50%以上表示BLAST中的Max. Identities的值为50以上。
[0077] 本发明中，玻连蛋白是指人玻连蛋白，具体地是由下述序列号3表示的全长495个 氨基酸残基构成的多肽。另外，还确认了天然的玻连蛋白是序列的一部分具有糖链的糖蛋 白。
[0078] 序列号3 :
[0079] DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFTMPEDEYTVYDDGEEKNNA TVHEQVGGPSLTSDLQAQSKGNPEQTPVLKPEEEAPAPEVGASKPEGIDSRPETLHPGRPQPPAEEELCSGKPFDA FTDLKNGSLFAFRGQYCYELDEKAVRPGYPKLIRDVWGIEGPIDAAFTRINCQGKTYLFKGSQYWRFEDGVLDPD YPRNISDGFDGIPDNVDAALALPAHSYSGRERVYFFKGKQYWEYQFQHQPSQEECEGSSLSAVFEHFAMMQRDSff EDIFELLFffGRTSAGTRQPQFISRDffHGVPGQVDAAMAGRIYISGMAPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRG RNQNSRRPSRATWLSLFSSEESNLGANNYDDYRMDWLVPATCEPIQSVFFFS⑶KYYRVNLRTRRVDTVDPPYPR SIAQYffLGCPAPGHL
[0080] <多肽>
[0081] 本发明的多肽（培养用多肽）是（1)含有CSYYQSC(序列号1)表示的氨基酸序列 且具有对培养器的吸附能力的、由40个?450个氨基酸残基构成的多肽，或者含有以下第 1区域和第2区域且由40个?450个氨基酸残基构成的多肽：
[0082] (1)含有选自CSYYQSC(序列号1)表示的氨基酸序列及RGD表示的氨基酸序列（以 下仅称作RGD序列）中的至少一个的第1区域；
[0083] (2)含有（2-i)PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN(序列号 2)表示的氨基酸序 列、（2-ii)与序列号2表示的氨基酸序列具有50%以上的同源性且具有对培养器的吸附能 力的氨基酸序列、或（3-iii)相对于序列号2表示的氨基酸序列附加、替换或缺失了 1个? 30个氨基酸残基、且具有对培养器的吸附能力的氨基酸序列的第2区域。
[0084] 所述第1区域含有选自序列号1表不的氨基酸序列及RGD序列中的至少一个。
[0085] 序列号1表示的氨基酸序列相当于玻连蛋白的氨基酸序列中的第25个?第31个 这7个氨基酸残基。另外，RGD序列是相当于玻连蛋白的氨基酸序列中的第45个?第47 个这3个氨基酸残基的细胞粘附性基序。推测这些氨基酸序列均是位于天然玻连蛋白的较 靠 N末端侧的序列，发挥与未分化多能干细胞的粘附性，其结果，能够使维持在未分化状态 的多能干细胞增殖。因此，不含有这些氨基酸序列中的任一个的多肽对细胞粘附性差，无法 获得本发明的效果。但是，本发明并不局限于该理论。
[0086] 另外，序列号1表示的氨基酸序列中的2个半胱氨酸残基在这两者间可以发生交 联。由此，有在序列号1表示的氨基酸序列中形成高级结构而与多能干细胞的粘附性提高 的倾向。
[0087] 这里"能够使多能干细胞以未分化状态增殖"是指多能干细胞在培养期间维持分 化能力。多能干细胞是否为未分化状态可通过已知的评价方法进行评价。例如，通过分子 标记物的表达（利用SSEA-4和/或Oct-4等流式细胞仪的表达测定、Oct-4和/或NANOG 等的免疫染色等）、体外实验中多能性分化的确认以及通过向免疫缺陷小鼠等移植进行畸 胎瘤形成的确认等本领域技术人员已知的方法进行。是否进行增殖可通过常规方法、利用 使用了各种显微镜的目视进行观察或者利用了 ALP活性等的反应试验、流式细胞仪等的手 法或其他手段来进行。另外，作为本发明的多能干细胞维持分化能力的维持培养期间，根据 培养条件及多能干细胞的细胞状态的不同而不同，例如可以为1个月的培养期间。
[0088] 所述培养用多肽中的第1区域只要具有选自序列号1表示的氨基酸序列及RGD序 列中的任一个即可，从细胞粘附性及细胞增殖性的观点出发，优选所述培养用多肽中的第1 区域含有这两个序列。
[0089] 所述第1区域还可以具有除序列号1表示的氨基酸序列及RGD序列以外的氨基酸 序列。作为这样的其他氨基酸序列，例如从第1区域的细胞粘附性及细胞增殖性的观点出 发，可以举出（Ia)由序列号3表示的人玻连蛋白的氨基酸序列的第1个?第24个氨基酸 残基构成的氨基酸序列、（Ib)由第48个?第55个氨基酸残基构成的氨基酸序列、或（Ic) 由第32个?第44个氨基酸残基构成的氨基酸序列等或它们的组合。其中，（Ia)?（Ic)的 氨基酸序列在不损害第1区域的细胞粘附性及细胞增殖性的范围内，可以分别具有替换、 缺失或删除了 1个?30个氨基酸残基而得到的序列，也可以是具有与（Ia)?（Ic)的氨基 酸序列的各个序列具有50 %以上同源性的氨基酸序列的序列。
[0090] 所述第1区域除了序列号1表示的氨基酸序列及RGD序列之外，还可含有选自 (la)?（Ic)的氨基酸序列中的至少1个，从细胞粘附性及细胞增殖性的观点出发，优选含 有序列号1表示的氨基酸序列及RGD序列这两者，且具有由序列号3表示的氨基酸序列的 第1个?第55个氨基酸残基构成的氨基酸序列或与其相近或其一部分的氨基酸序列。
[0091] 所述第1区域的氨基酸残基数从细胞粘附性及增殖性的观点出发，可以为3?60 个氨基酸残基数，优选为10?55个氨基酸残基数。
[0092] 所述第2区域含有由序列号2表示的32个氨基酸残基构成的氨基酸序列，从培养 用多肽的精制容易性的观点出发，优选由序列号2表示的氨基酸序列构成。序列号2表示 的氨基酸序列含有在位于天然玻连蛋白的C末端侧的血红素结合蛋白样结构域II的一部 分中，相当于由序列号3表示的氨基酸序列的第342个?第373个氨基酸残基构成的肝素 结合域。以下，有时将序列号2表示的氨基酸序列称作肝素结合域。
[0093] 推测所述培养用多肽通过具有所述肝素结合域而具有对培养器的吸附能力。其结 果，可以使未分化多能干细胞维持未分化状态地长期进行培养，但本发明并不限于该理论。 [0094]另外，所述培养用多肽通过含有所述肝素结合域而有确保所述培养用多肽的亲水 性、抑制多肽的疏水凝集的倾向。其结果，所述培养用多肽变得易于精制，从而能够提高制 造效率。
[0095] 这里，"具有对培养器的吸附能力"是指所述氨基酸序列对作为对象的培养器的细 胞培养表面（以下有时仅称作"培养表面"）不发生化学反应、而是物理性地吸附。对培养 器的培养表面是否具有吸附能力例如可如下评价：向进行了等离子体处理的聚苯乙烯制培 养器中添加含有该多肽的溶液，使其达到200pm 〇l/cm2，在37°C下放置2小时之后，在使用 磷酸缓冲液洗涤2次时，残留于培养皿表面的该多肽是否存在lOpmol/cm 2以上，从而进行 评价。
[0096] 这里，残留于培养皿表面的多肽的量可通过对与识别多肽的抗体的结合量进行定 量的ELISA (酶联免疫分析，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)法或利用HPLC等对所 吸附的多肽进行水解而产生的氨基酸进行定量来测定。
[0097] 所述肝素结合域还可以是与序列号2表示的氨基酸序列具有50%以上、优选为 80%以上、更优选为90%以上、进一步优选为95%以上的同源性，同时能够使多能干细胞 以未分化状态增殖且具有对培养器的吸附能力的氨基酸序列。
[0098] 另外，所述肝素结合域也可以是由相对于序列号2表示的氨基酸序列缺失、替换 或附加有1个?30个、优选为1个?15个、优选为1个?6个氨基酸的氨基酸序列构成、 且具有对培养器的吸附能力的氨基酸序列。
[0099] 所述培养用多肽只要具有所述第1区域和所述第2区域即可，其相对位置并无特 别限定。所述培养用多肽中，优选第1区域位于所述第2区域的N末端侧。
[0100] 所述培养用多肽由40个?450个氨基酸残基构成。不足40个氨基酸残基时，不 能说细胞粘附性或细胞增殖性或对培养器的吸附能力是充分的。而超过450个氨基酸残基 时，有时会无法适当地发挥细胞粘附性或细胞增殖性及对培养器的吸附能力，进而易于引 起蛋白之间的缔合、交联或形成凝集。所述培养用多肽从难以引起凝集形成等的观点出发， 优选为80个以上、更优选为90个以上、进一步优选为100个以上，另一方面，优选为400个 以下、更优选为250个以下、进一步优选为170个以下、更进一步优选为150个以下。这些上 限值或下限值可以任意组合，例如优选由40个?400个氨基酸残基构成，更优选由80个? 250个氨基酸残基构成，进一步优选由80个?150个氨基酸残基构成，更进一步优选由100 个?150个氨基酸残基构成。
[0101] 所述培养用多肽从防止疏水凝集的观点出发，优选具有一 2. 0?一 0. 95的GRAVY 值。GRAVY 值（Kyte J·，Doolittle R.F. (1982)，J. Mol. Biol, 157:105-132)表示多肽的疏 水度的总平均。GRAVY的值越大，则表示疏水度越高。GRAVY值为一 0. 95以下时，具有能够 容易地抑制疏水凝集的发生的倾向。而为一 2. 0以上时，使对培养器表面的吸附及未分化 细胞的增殖变得容易，随着GRAVY值增大，有吸附性及细胞增殖性提高的倾向。作为多肽的 GRAVY值，从兼顾抑制凝集形成与吸附性或细胞增殖性的角度出发，更优选为一 1. 70?一 0. 975、进一步优选为一 1. 60?一 1. 10。氨基酸残基数越少，则越具有发生凝集的倾向，因 此当氨基酸残基数为80?170个多肽时，从兼顾抑制凝集形成与吸附性或细胞增殖性的角 度出发，GRAVY值优选为一1. 70?一0. 975、更优选为一1. 60?一1. 10。
[0102] 为了对GRAVY值进行调整，可通过增减序列中的例如疏水性氨基酸（例如Trp、 Tyr、Phe、Leu、lie、Val或Met)的比例或增减氨基酸残基数等来进行调整。
[0103] 所述培养用多肽优选具有除所述第1区域及所述第2区域以外的其他氨基酸序 列。从适当地发挥细胞粘附性及对培养器的吸附能力的观点出发，所述培养用多肽优选含 有序列号3表示的多肽、即人玻连蛋白的氨基酸序列的部分序列。由此，所述培养用多肽可 获得接近于人玻连蛋白的性质，例如对多能干细胞优异的粘附性及增殖性。
[0104] 作为所述培养用多肽中可含有的人玻连蛋白的部分氨基酸序列，从所述培养用多 肽的细胞粘附性及细胞增殖性、或对培养器的吸附能力、或抑制凝集形成的观点出发，优选 含有选自以下第3区域及第4区域中的至少1个：
[0105] (3)由从含有序列号3表示的氨基酸序列中第56个?第341个氨基酸残基的氨基 酸序列及其部分氨基酸序列中选择的氨基酸序列构成的第3区域、及
[0106] (4)由从含有序列号3表示的氨基酸序列中第374个?第459个氨基酸残基的氨 基酸序列及其部分氨基酸序列中选择的氨基酸序列构成的第4区域。
[0107] 作为所述第3区域，从多肽制作时具有抑制疏水凝集的倾向的观点出发，可以选 择（3a)由序列号3表示的氨基酸序列中第132个?第341个氨基酸残基构成的氨基酸序 列及其部分氨基酸序列，或可以选择（3b)由第269个?第341个氨基酸残基构成的氨基酸 序列或其部分氨基酸序列，或可以选择（3c)由第274个?第341个氨基酸残基构成的氨基 酸序列或其部分氨基酸序列，或可以为（3d)由第294个?第341个氨基酸残基构成的氨基 酸序列或其部分氨基酸序列。（3a)?（3d)的氨基酸序列中，通过减少氨基酸残基数，有可 以减轻疏水凝集的倾向。其中，选择（3d)的氨基酸序列由于具有可以更为确实地抑制疏水 凝集的倾向，因此优选。
[0108] 作为所述第4区域，从对培养皿的吸附性的观点出发，可以为由第374个?第459 个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，也可以为由第374个?第409个氨 基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，也可以为由第374个?第379个氨基酸 残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列。
[0109] 其中，除了对培养皿的吸附性之外，还从多肽制作时易于抑制疏水凝集的角度出 发，优选为第374个?第379个，通过减少所选择的氨基酸数，具有减轻疏水凝集的倾向。
[0110] 构成所述第3区域及第4区域的氨基酸序列的部分氨基酸序列是指在特定范围的 氨基酸残基中，由连续的3个氨基酸残基以上构成的氨基酸序列。这些部分氨基酸序列的 氨基酸残基数可以在不超过上述所述培养用多肽的总氨基酸残基数的范围内选择。
[0111] 其中，构成所述第3区域及第4区域的氨基酸序列及其部分氨基酸序列可以是与 各个氨基酸序列或其部分序列具有优选为80%以上、更优选为90%以上、更优选为95%以 上、进一步优选为95%以上的同源性的氨基酸序列或其部分氨基酸序列。这些氨基酸序列 可以在不损害所述培养用多肽的细胞粘附性及对培养器的吸附性的范围内选择。
[0112] 另外，构成所述第3区域及第4区域的氨基酸序列及其部分氨基酸序列可以是相 对于各个氨基酸序列或其部分序列缺失、替换或附加有1个?30个、优选为1个?15个、 更优选为1个?5个氨基酸残基的氨基酸序列。缺失等有这些氨基酸残基的氨基酸序列可 以在不损害所述培养用多肽的细胞粘附性及对培养器的吸附性的范围内选择。
[0113] 所述培养用多肽通过含有所述第3区域，所述培养用多肽具有有提高与培养皿的 吸附性的优点的倾向。通过含有所述第4区域，所述培养用多肽具有有进一步提高与培养 皿的吸附性的优点的倾向。所述培养用多肽只要具有第3及第4区域中的任一个即可。
[0114] 另外，所述培养用多肽的GRAVY值从调整容易性的观点出发，优选通过构成第3及 第4区域的氨基酸序列中的氨基酸残基数的增减、氨基酸残基的替换、缺失、附加等来进行 调整，更优选调整构成第3区域的氨基酸序列的长度。
[0115] 所述培养用多肽可不含有在序列号3表示的氨基酸序列中第56个?第131个氨 基酸残基、也可不含有第56个?第268个氨基酸残基、也可不含有第269个?第273个氨 基酸残基、或者可不含有第50个?第293个氨基酸残基。推测由这些氨基酸残基构成的氨 基酸序列对所述培养用多肽的多能性细胞培养的性能没有帮助，从与培养皿的吸附的观点 出发，选择适合的序列。
[0116] 所述第3区域含有对应于序列号3表示的序列的半胱氨酸残基的氨基酸残基时， 该半胱氨酸残基的位置可以具有除半胱氨酸残基以外的氨基酸残基。由此，可以防止因半 胱氨酸残基导致的分子内或分子间形成交联，因此优选。作为替换半胱氨酸残基的其他氨 基酸残基并无特别限定，可以举出丝氨酸残基、丙氨酸残基、甘氨酸残基等。其中，从具有与 半胱氨酸类似的结构的角度出发，优选丝氨酸残基、丙氨酸残基。
[0117] 另外，所述培养用多肽在不损害细胞粘附性及对培养器的吸附性的范围内，还可 具有除上述以外的其他附加的任意氨基酸残基。作为由这样的其他任意氨基酸残基构成的 序列，例如可以举出为了利用重组技术容易地制作所述培养用多肽而附加的附加序列。作 为这样的附加序列，可以举出N末端侧的蛋氨酸残基、N末端侧的GPLG序列、标签序列（例 如GST (谷胱甘肽-S-转移酶）、FLAG标签、His标签等）、可附加在各区域间的连接序列（例 如 GGGS、GGGGS、GGGGGS 等）等。
[0118] 所述培养用多肽可通过本领域技术人员已知的氨基酸合成技术或基因重组技术 来制造。
[0119] 利用基因重组技术获得本发明的培养用多肽时，具体而言首先获取编码作为对象 的氨基酸序列的基因，将其组装到表达载体中，制作重组表达载体，将其导入到适当的宿主 中，制作转化体。通过用适当的培养基对所得的转化体进行培养，产生目标多肽，因此通过 利用常规方法从培养物中将目标多肽回收，从而可获得本发明的多肽。
[0120] 作为所述培养用多肽，从细胞增殖性及未分化多能干细胞的未分化状态下的增殖 能力等的观点出发，优选为由80个?450个氨基酸残基构成的多肽（A)，其含有：（1)由下 述氨基酸序列构成的第1区域，所述氨基酸序列由序列号3表示的氨基酸序列的第25个? 第47个氨基酸残基构成，（2)由下述氨基酸序列构成的第2区域，所述氨基酸序列由序列 号3表示的氨基酸序列的第342个?第373个氨基酸残基构成，以及选自以下第3区域及 第4区域中的至少1个：（3)由氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第3区域，所述氨基 酸序列由序列号3表示的氨基酸序列的第269个?第341个氨基酸残基构成，及（4)由下 述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第4区域，所述氨基酸序列由序列号3表示的氨 基酸序列的第374个?第459个氨基酸残基构成。
[0121] 另外，作为所述培养用多肽，从细胞增殖性及未分化多能干细胞的未分化状态下 的增殖能力等的观点出发，优选为由100个?450个氨基酸残基构成的多肽（B)，其含有： (1)由下述氨基酸序列（含有序列号1表示的氨基酸序列和RGD序列）构成的第1区域，所 述氨基酸序列由下述序列号3表示的氨基酸序列的第1个?第55个氨基酸残基构成，（2) 由下述氨基酸序列构成的第2区域（肝素结合域），所述氨基酸序列由序列号3表示的氨基 酸序列的第342个?第373个氨基酸残基构成，以及选自以下第3区域及第4区域中的至 少1个：（3)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第3区域，所述氨基酸序列由序 列号3表示的氨基酸序列的第269个?第341个氨基酸残基构成，及（4)由下述氨基酸序 列或其部分氨基酸序列构成的第4区域，所述氨基酸序列由序列号3表示的氨基酸序列的 第374个?第459个氨基酸残基构成。
[0122] 另外，上述多肽（A)或（B)进一步优选是GRAVY值为一 2. 0?一 0. 95的多肽。
[0123] 另外，上述多肽（A)优选氨基酸残基数为80个?250个。
[0124] 此外，上述多肽㈧进一步优选是GRAVY值为一2. 0?一0. 95且氨基酸残基数为 80个?250个的多肽。
[0125] 此外，上述多肽（A)还进一步优选是GRAVY值为一 1.70?一 0.975且氨基酸残基 数为80个?250个的多肽。
[0126] 另外，上述多肽（A)或（B)优选氨基酸残基数为100个?250个。
[0127] 此外，上述多肽（A)或（B)进一步优选是GRAVY值为一 2.0?一 0.95且氨基酸残 基数为100个?250个的多肽。
[0128] 此外，上述多肽（A)或（B)还进一步优选是GRAVY值为一 1.70?一 0.975且氨基 酸残基数为100个?250个的多肽。
[0129] 此外，上述多肽（A)或（B)还进一步优选是GRAVY值为一 1.70?一 0.975且氨基 酸残基数为100个?170个的多肽。
[0130] 以下举出所述培养用多肽的一个例子，但本发明并不限定于这些。
[0131] 表 1
[0132]

【权利要求】
1. 一种由40个?450个氨基酸残基构成的多肽，其含有： (1) 含有选自CSYYQSC即序列号1表示的氨基酸序列及RGD表示的氨基酸序列中的至 少一个的第1区域；及 (2) 含有（2-i)PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN即序列号2表示的氨基酸序列、 (2-ii)与序列号2表示的氨基酸序列具有50%以上的同源性且具有对培养器的吸附能力 的氨基酸序列、或（2-iii)相对于序列号2表示的氨基酸序列附加、替换或缺失了 1个?30 个氨基酸残基、且具有对培养器的吸附能力的氨基酸序列的第2区域。
2. 根据权利要求1所述的多肽，其GRAVY值为一 2. 0?一 0. 95。
3. 根据权利要求1或2所述的多肽，其中，所述第1区域含有CSYY QSC即序列号1表 示的氨基酸序列及RGD表示的氨基酸序列这两者。
4. 根据权利要求1?3中任一项所述的多肽，其由40个?400个氨基酸残基构成。
5. 根据权利要求1?4中任一项所述的多肽，其进一步含有由下述（3-i)?（3-iii) 中的任一个氨基酸序列构成的第3区域： (3-i)由序列号3表示的氨基酸序列中第56个?第341个氨基酸残基构成的氨基酸序 列或其部分氨基酸序列， (3-ii)与所述（3-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有50%以上的同源性的氨 基酸序列，及 (3-iii)相对于所述（3-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列附加、替换或缺失了 1 个?30个氨基酸残基的氨基酸序列。
6. 根据权利要求1?4中任一项所述的多肽，其进一步含有由下述（3a-i)?（3a-iii) 中的任一个氨基酸序列构成的第3区域： (3a-i)由第132个?第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列， (3a_ii)与所述（3a_i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有50%以上的同源性的 氨基酸序列，及 (3a_iii)相对于所述（3a_i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列附加、替换或缺失了 1 个?30个氨基酸残基的氨基酸序列。
7. 根据权利要求1?4中任一项所述的多肽，其进一步含有由下述（3b-i)?（3b-iii) 中的任一个氨基酸序列构成的第3区域： (3b-i)由第269个?第341个氨基酸残基构成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列， (3b-ii)与所述（3b-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有50%以上的同源性的 氨基酸序列，及 (3b-iii)相对于所述（3b-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列附加、替换或缺失了 1 个?30个氨基酸残基的氨基酸序列。
8. 根据权利要求1?7中任一项所述的多肽，其进一步含有由下述（4-i)?（4-iii) 中的任一个氨基酸序列构成的第4区域： (4-i)由在序列号3表示的氨基酸序列中第374个?第459个氨基酸残基构成的氨基 酸序列或其部分氨基酸序列， (4-ii)与所述（4-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有50%以上的同源性的氨 基酸序列，及 (4-iii)相对于所述（4-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列附加、替换或缺失了 1 个?30个氨基酸残基的氨基酸序列。
9. 根据权利要求1?8中任一项所述的多肽，其中，所述（2-ii)的氨基酸序列相对于 序列号2表示的氨基酸序列的同源性为80%以上。
10. 根据权利要求1?8中任一项所述的多肽，其中，所述（2-iii)的氨基酸序列相对 于序列号2表示的氨基酸序列附加、替换或缺失的氨基酸残基数为1?15。
11. 一种由80个?450个氨基酸残基构成的多肽，其含有： (1) 由下述氨基酸序列构成的第1区域，所述氨基酸序列由序列号3表示的氨基酸序列 的第25个?第47个氨基酸残基构成， (2) 由下述氨基酸序列构成的第2区域，所述氨基酸序列由序列号3表示的氨基酸序列 的第342个?第373个氨基酸残基，以及 选自以下第3区域及第4区域中的至少1个： (3) 由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第3区域，所述氨基酸序列由序列 号3表示的氨基酸序列的第269个?第341个氨基酸残基构成，及 (4) 由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第4区域，所述氨基酸序列由序列 号3表示的氨基酸序列的第374个?第459个氨基酸残基构成。
12. -种由100个?450个氨基酸残基构成的多肽，其含有： (1) 由下述氨基酸序列构成的第1区域，所述氨基酸序列由序列号3表示的氨基酸序列 的第1个?第55个氨基酸残基构成， (2) 由下述氨基酸序列构成的第2区域，所述氨基酸序列由序列号3表示的氨基酸序列 的第342个?第373个氨基酸残基构成，以及 选自以下第3区域及第4区域中的至少1个： (3) 由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第3区域，所述氨基酸序列由序列 号3表示的氨基酸序列的第269个?第341个氨基酸残基构成，及 (4) 由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列构成的第4区域，所述氨基酸序列由序列 号3表示的氨基酸序列的第374个?第459个氨基酸残基构成。
13. 根据权利要求11或12所述的多肽，其GRAVY值为一 2. 0?一 0. 95。
14. 根据权利要求1?13中任一项所述的多肽，其中，氨基酸残基数为250个以下。
15. 根据权利要求5?14中任一项所述的多肽，其中，所述多肽含有第3区域，所述第 3区域在对应于序列号3表示的氨基酸序列的半胱氨酸残基的位置上具有除半胱氨酸残基 以外的氣基酸残基。
16. 根据权利要求5?14中任一项所述的多肽，其中，所述多肽含有第3区域，所述第 3区域在对应于序列号3表示的氨基酸序列的半胱氨酸残基的位置上具有丝氨酸残基、丙 氨酸残基或甘氨酸残基。
17. 根据权利要求1?16中任一项所述的多肽，其中，所述第1区域位于所述第2区域 的N末端侧。
18. 根据权利要求1?17中任一项所述的多肽，其中，序列号1表示的氨基酸序列中的 2个半胱氨酸残基在两者间形成交联。
19. 一种多肽，其具有序列号4?序列号23、序列号38及序列号39中的任一个表不的 氨基酸序列。
20. -种由40个?450个氨基酸残基构成的多肽，其含有（l)CSYY QSC即序列号1表 示的氨基酸序列且具有对培养器的吸附能力。
21. 根据权利要求20所述的多肽，其进一步含有RGD表示的氨基酸序列。
22. 根据权利要求20或21所述的多肽，其GRAVY值为一 2. 0?一 0. 95。
23. -种多能干细胞的培养方法，其包含： 对支撑载体的细胞培养表面赋予权利要求1?22中任一项所述的多肽，获得多肽包覆 培养表面；以及 在所述多肽包覆培养表面上接种多能干细胞并进行培养。
24. 根据权利要求23所述的多能干细胞的培养方法，其中，所述多能干细胞为选自胚 胎干细胞、诱导型多能干细胞、成体干细胞、受精卵内细胞集合细胞及早期胚胎细胞中的至 少一种。
25. 根据权利要求23或24所述的多能干细胞的培养方法，其中，所述多能干细胞为诱 导型多能干细胞。
26. 根据权利要求23?25中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其为在不存在异种 动物来源成分及血清来源成分的情况下对所述多能干细胞进行培养。
27. 根据权利要求23?26中任一项所述的多能干细胞的培养方法，其中，所述多肽在 所述细胞培养表面上的赋予量为lpmol/cm 2?1000pmol/cm2。
28. -种培养器，其具有： 具有细胞培养表面的支撑载体、和 配置于所述支撑载体的细胞培养表面上的权利要求1?22中任一项所述的多肽。
【文档编号】C12M1/00GK104271593SQ201380022493
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年4月24日 优先权日:2012年5月1日
【发明者】村上裕太, 岩田里江, 岩木义英, 佐佐木翼 申请人:富士胶片株式会社