一种浅部真菌分离培养鉴定系统的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种能迅速鉴定出多种不同菌种的浅部真菌分离培养鉴定系统。本发明包括一三分隔平皿，在所述三分隔平皿上的每一格内分别含有DIM培养基、尿素培养基和BCP-MS-G培养基，所述DIM培养基呈浅绿色，所述尿素培养基呈黄色，所述BCP-MS-G培养基呈灰蓝色，所述三分隔平皿经无菌密封包装，保存于2～8℃冰柜中；本发明根据形成的菌落形态、性状、颜色结合显微镜下菌丝或孢子的大小、形态以及排列规律等特点即可迅速鉴定此致病真菌属于何种真菌。本发明可应用于菌种鉴定领域。
【专利说明】一种浅部真菌分离培养鉴定系统【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鉴定系统，尤其涉及一种浅部真菌分离培养鉴定系统。
【背景技术】
[0002]浅部真菌主要为皮肤丝状菌(Dermatophytes)，侵犯皮肤、毛发、指甲等角化组织引起癣症，又称癣菌(Ringworm),分为三属,共37个种。癣症病灶可见有隔菌丝和关节孢子，菌丝深入角化组织内生成营养菌丝体，纵横交织成网状，孢子可排列成链状或零散分布，在病发上可见孢子在毛干外排成厚鞘(毛外型感染)或毛干内排列成串(毛内型感染)。在沙保氏培养基孵育I~3周，可生成丝状型菌落，产生各种孢子和菌丝。根据菌落形态与色泽，菌丝的构造与形态，大分生孢子的形态和小分生孢子的有无及排列形式等，可作为鉴别种属的重要依据。癣菌主要由孢子散播传染，常由于接触患癣的人或动物(狗、猫、牛、马等)及染菌物体而感染。在临床上同一种癣症可由数种不同癣菌引起，而同一种癣菌因侵害部位不同，又可引起不同的癣症。
[0003]浅部真菌病简称为癣，是由寄生于角蛋白组织的致病真菌所引起的皮肤病，其病原菌可分为:
1.皮肤癣菌:寄生在皮肤角蛋白组织致病真菌统称为皮肤癣菌。该菌凭其侵犯组织不同和培养特点差异把它再划分以下三属:
I)毛癣菌属:侵犯皮肤、毛发和甲。本菌属已查明有13种可使人类致病。常见有黄癣菌、红色毛癣菌、断发毛癣菌、紫色毛癣菌、石膏样毛癣菌等；培养特点为呈棒形大分子孢子，壁光滑。
[0004]2)孢子菌属:侵犯`毛发及皮肤，在我国以铁锈色小孢子菌、羊毛样小孢子菌等为多见；培养特征是梭形大分子孢子，壁有刺。已报道有8种能引起人类发病。
[0005]3)表皮癣菌属:侵犯皮肤和甲。本菌属仅絮状表皮癣菌一种可使人类致病，其培养所见呈杵状或梨形大分子孢子。
[0006]上述三属的皮肤癣菌，感染人体后可引起组织反应而发生红斑丘疹、水疱、鳞屑、断发、脱发和甲板改变等。按其侵犯部位差别，临床可分为头癣、体癣、股癣、手足癣和甲癣。
[0007]2.角层癣菌:寄生于皮肤角层或毛干表面的致病真菌可谓之角层癣菌。此类癣菌又分两型，即角层型和毛发型。前者有花斑癣菌、红癣微细棒状杆菌，曼逊氏癣菌及威尼克氏癣菌；后一型有腋毛癣菌。
[0008]由于角层癣菌是寄生于人体组织的表面，故一般不引起组织的炎症反应，即使有也极轻微。
[0009]浅部真菌病流行颇广，遍布在世界各地区，在我国也是常见多发病。本病传染方式:一则直接接触传染，如头癣的发病往往是直接接触罹患头癣的儿童或患有癣病的动物后引起；二则间接接触传染，如经常使用癣病患者用过的东西，象拖鞋、枕巾、擦脚布等就可能发生癖。
[0010]浅部真菌病可根据病史，临床表现特点，诊断一般较容易。必要时可进行如下辅助检查:
真菌显微镜检查:选取皮损边缘的鳞屑或病发几根。置于玻片上，加入氢氧化钾溶液一滴，加盖玻片。然后放在酒精灯上加热片刻，以促进角质溶解。最后进行镜检观察。真菌检查阳性对诊断有确诊作用，如阴性也不能排除癣的诊断。
[0011]真菌培养:常规的培养基是采用沙堡弱(sabourauad)培养基。将从病灶取来的鳞屑、毛发或疱膜接种后，放入25~30°C恒温箱中培养。一般5天左右即可见菌落生长，随后可进行菌种鉴定。如经三星期培养无菌落生长，可报告培养阴性。
[0012]滤过紫外线灯检查:该灯又名伍德(wood)灯，系紫外线通过含有氧化镍的玻璃装置，于暗室里，可见到某些真菌，在滤过紫外线灯照射下产生带色彩的荧光。这样可根据荧光的有无以及色彩不同，在临床上对浅部真菌病，尤其头癣的诊断提供重要参考。此外，本灯对诸如托儿所群体检查也有帮助。
[0013]组织病理检查:浅部真菌病一般无需组织病理学检查。体股癣或手足癣一般在角质层可见到菌丝或孢子；叠瓦癣真菌可深达棘层；花斑癣在角质层可见到菌丝和孢子；马拉色菌毛囊炎可见毛囊扩张及毛囊角栓，毛囊皮脂腺漏斗部及周围上皮炎性浸润或脓肿形成，可见孢子；甲真菌病显示皮肤癣菌多侵犯甲板中层，菌丝沿甲板纤维平行生长，可见关节孢子。
[0014]皮肤癣菌培养基(DTM)是1969年由Taplin等发明并应用于头癣致病真菌的分离和鉴定。皮肤癣菌鉴定培养基(DIM)是由Salkin等于1997年报道的用于皮肤癣菌鉴定的培养基。DTM在基础营养培养基中加入了抗生素和放线菌酮，在皮肤癣菌选择性生长的同时能够有效地防止细菌和大多数其它真菌的污染，添加了指示剂酚红，皮肤癣菌生长时产生的碱性代谢产物可以使培养基由黄色变为红色，能够快速发现皮肤癣菌生长。DIM增加了葡萄糖含量，加入指示剂溴甲酚紫，同时提高了放线菌酮的浓度，能够更有效的抑制污染菌的生长，增加了 37°C培养这一条件，认为在37°C培养时能够更加特异地分离和鉴定皮肤癣菌。`
[0015]KAHE/FISCHER系统是近些年发展起来的一种最新的皮肤癣菌鉴定方法，结合显微镜下形态学观察，可以鉴定20余种皮肤癣菌，具有准确率高、受污染少、影响小的优点。但该系统比较繁杂，而经过改良的系统以溴甲酚紫固体葡萄糖琼脂(BCP-MS-G)和尿素培养基为主，可通过颜色变化以及水解晕的产生鉴定皮肤癣菌。可用于鉴定临床常见的皮肤癣菌如红色毛癣菌,须癣毛癣菌，石膏小孢子菌，紫色毛癣菌等。
[0016]在临床上，直接镜检法检查真菌因其简便、快速而成为最为普遍的真菌检查法。镜检阳性可确定为真菌感染，但一般不能确定致病菌种；镜检阴性不能排除真菌感染，如高度怀疑真菌感染可多次重复直接镜检或进行真菌培养。如果有相关的产品能用于分离培养鉴定浅部真菌，则可指导临床医生根据病原学特点有针对性的选择抗真菌药物，对于浅部真菌的治疗具有重要意义。
【发明内容】
[0017]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能迅速鉴定出多种不同菌种的浅部真菌分离培养鉴定系统。
[0018]本发明所采用的技术方案是:本发明所述浅部真菌分离培养鉴定系统包括一三分隔平皿，在所述三分隔平皿上的每一格内分别含有DIM培养基、尿素培养基和BCP-MS-G培养基，所述DM培养基呈浅绿色，所述尿素培养基呈黄色，所述BCP-MS-G培养基呈灰蓝色，所述三分隔平皿经无菌密封包装，保存于2~8°C冰柜中。
[0019]所述DM培养基包含有葡萄糖、大豆蛋白胨、琼脂、指示剂溴甲酚紫和抗生素系统，所述DM培养基的pH值为6.1±0.1。
[0020]所述尿素培养基包含有尿素、葡萄糖、琼脂、指示剂酚红和抗生素系统，所述尿素培养基的pH值为7.2±0.1。
[0021]所述BCP-MS-G培养基包含有脱脂奶粉、葡萄糖、琼脂、指示剂溴甲酚紫和抗生素系统，所述BCP-MS-G培养基的pH值为6.8±0.I。
[0022]本发明的有益效果是:本发明由适用于浅部真菌生长及分离鉴定的各种营养物质，经无菌浇注密封而成，浅部真菌能在培养基上生长出大量的菌落，该系统主要由含有适于浅部真菌分离及鉴定的改良DIM培养基(浅绿色)、尿素培养基(黄色)、BCP-MS-G培养基(灰蓝色)和三分隔平皿组成；用于临床时的操作方式为:收集具有活性菌落的指(趾)甲、皮屑、毛发等标本，尽量剪碎，采用点植法，标本应在2小时内接种完毕，置于25-28°C培养3-5天，每天观察结果；根据形成的菌落 形态、性状、颜色结合显微镜下菌丝或孢子的大小、形态以及排列规律等特点即可迅速判断出此致病真菌属于何种真菌，必要时可做进一步生化鉴定实验。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是所述三分隔平皿的俯视结构示意图。
【具体实施方式】
[0024]下面就具体实施例对本发明做进一步阐述:
1.培养基配制=DIM培养基(改良皮肤癣菌培养基)成分:大豆蛋白胨IOg ;葡萄糖20g ；琼脂20g ；1.6%溴甲酚紫溶液Iml ;氯霉素0.1g ;庆大霉素0.1g ;纯化水加至1000ml ;用IMHCl 调 pH 值至 6.1±0.I。
[0025]制法:将大豆蛋白胨、葡萄糖和琼脂加至水中，文火加热溶解；边搅拌，边加溴甲酚紫液，用IM HCl调pH值，121°C高压灭菌15min。冷至50~55°C，加入经除菌过滤氯霉素及庆大霉素，分装于三分隔平皿的一格内，如图1所示，并冷却。
[0026]尿素培养基成分:胰蛋白胨Ig ;氯化钠5g ;葡萄糖50g ;磷酸二氢钾2g ；0.4%酹红溶液3mL ;琼脂20g ;20%尿素溶液IOOmL ;氯霉素0.1g ;庆大霉素0.1g ;纯化水加至1000ml ；用 IM NaOH 调 pH 值至 7.2±0.I。
[0027]制法:将除尿素、琼脂、氯霉素、庆大霉素以外的成分配好，用IM NaOH调pH值，加入琼脂，加热溶化并分装烧瓶。121°C高压灭菌15min。冷至50~55°C，加入经除菌过滤的尿素溶液、氯霉素及庆大霉素。分装于三分隔平板的一格内，冷却。
[0028]BCP-MS-G培养基成分:脱脂奶粉40g ；1.6 %溴甲酚紫醇溶液Iml ;琼脂15g ;葡萄糖20g ;氯霉素0.1g ;庆大霉素0.1g ;纯化水加至1000ml ;用IM NaOH调pH值至6.8±0.1。
[0029]制法:将除琼脂、氯霉素、庆大霉素以外的成分配好，用IM NaOH调pH值，加入琼月旨，加热溶化并分装烧瓶。121°C高压灭菌15min。冷至50~55°C，加入经除菌过滤的氯霉素及庆大霉素。分装于三分隔平板的一面内，冷却。
[0030]2.将制作好的含三种培养基的三分隔平皿，无菌密封包装，保存于2~8°C冰柜，切忌冷冻保存。
[0031]3.使用时，从冰柜中取出所需数量的培养基，复温。取各类标本直接接种，指(趾)甲、皮屑、毛发等固型标本，应尽量剪碎，采用点植法；标本应在2小时内接种完毕。接种好的培养基，置于25-28°C培养3-5天，每天观察结果。
[0032]4.根据形成的菌落形态、性状、颜色结合显微镜下菌丝，孢子的大小，形态以及排列规律等特点报告此致病真菌属于何种真菌。必要时可做进一步生化鉴定实验。
[0033]下述列举了多种不同菌种在本发明系统中进行鉴定时的生长情况和鉴定方法: 紫色毛癣菌:菌落生长很慢，菌落小，能使浅绿色的DIM培养基显紫色，使灰蓝色的
BCP-MS-G培养基变紫色透明，使黄色的尿素培养基变红褐色；
红色毛癣菌:菌落生长较慢，能使浅绿色的DM培养基显紫色，使灰蓝色的BCP-MS-G培养基变灰绿色；
须癣毛癣菌:菌落生长较快，能使浅绿色的DIM培养基显紫色，使黄色的尿素培养基显粉红色；
石膏样小孢子菌:生长较快 ，呈现弥漫的石膏粉末样菌落，能使浅绿色的DIM培养基显紫色，使灰蓝色的BCP-MS-G培养基变蓝紫色。
[0034]犬小孢子菌:生长快，呈黄色菌落，培养基不变色。
[0035]酵母样真菌:生长快，使浅绿色的DM培养基显黄色，使灰蓝色的BCP-MS-G培养基显黄色;
其他真菌:生长快，使浅绿色的DIM培养基显黄色，使灰蓝色的BCP-MS-G培养基显白色。
[0036]本发明可应用于菌种鉴定领域。
【权利要求】
1.一种浅部真菌分离培养鉴定系统，其特征在于:它包括一三分隔平皿，在所述三分隔平皿上的每一格内分别含有DIM培养基、尿素培养基和BCP-MS-G培养基，所述DIM培养基呈浅绿色，所述尿素培养基呈黄色，所述BCP-MS-G培养基呈灰蓝色，所述三分隔平皿经无菌密封包装，保存于2~8°C冰柜中。
2.根据权利要求1所述的一种浅部真菌分离培养鉴定系统，其特征在于:所述DIM培养基包含有葡萄糖、大豆蛋白胨、琼脂、指示剂溴甲酚紫和抗生素系统，所述DM培养基的pH 值为 6.1±0.I。
3.根据权利要求1所述的一种浅部真菌分离培养鉴定系统，其特征在于:所述尿素培养基包含有尿素、葡萄糖、琼脂、指示剂酚红和抗生素系统，所述尿素培养基的PH值为7.2±0.I。
4.根据权利要求1所述的一种浅部真菌分离培养鉴定系统，其特征在于:所述BCP-MS-G培养基包含有脱脂奶粉、葡萄糖、琼脂、指示剂溴甲酚紫和抗生素系统，所述BCP-MS-G培养基的pH值为6.`8±0.I。
【文档编号】C12Q1/04GK103773680SQ201410017629
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】孙宜峰, 龚惠勇, 曾冰冰 申请人:珠海市银科医学工程有限公司