籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法
【专利摘要】本发明提出了一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，包括：种子DNA的直接提取；PCR扩增反应；所述PCR反应的体系中1对SSR引物有两种选择，一种选择序列为正向引物5’-CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3’和反向引物5’-GCACAAGGTGAGCAGTCC-3’；另一种选择序列为正向引物5’-CAAAAACAGAGCAGATGAC-3’和反向引物5’-CTCAAGATGGACGCCAAGA-3’；凝胶电泳检测；种子纯度计算。本发明的鉴定方法具有准确、简单和快速的特点。
【专利说明】籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及种子检测【技术领域】，特别是指一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 籼粳杂交稻是利用水稻籼粳杂交集聚亚种间有利基因选育综合性状优良的强优势杂交水稻组合，是我国杂交水稻育种研究的战略重点，将在稳定我省粮食总量，保障口粮安全，促进农民增产增收发挥重要作用。
[0003]籼粳交水稻种子中含有大量淀粉(65%_70%)、蛋白质(7%_9%)及脂肪(2%_3%)，这些物质的存在很大程度上影响了种子内直接提取的DNA的质量。现在传统的做法是将种子进行标准发芽，等幼苗长到一定大小后在幼苗叶片中提取种子的DNA，这种方法大大延长了DNA提取的周期，从而降低了室内分子标记鉴定种子纯度快速高效性。
[0004]种子真实性和纯度是杂交水稻种子质量的核心指标，是种子质量分级的主要标准，是企业购销种子的关键依据，优良品种种子混杂，纯度降低将阻碍品种优良遗传性能的充分发挥，导致作物产量和质量的明显降低，不仅对生产、销售产生巨大影响，还将给国家、政府、农民造成重大损失。随着作物选育品种数目的增多及育种材料遗传基础的日益狭窄，使得品种间的遗传差异越来越小，导致品种真实性和纯度鉴定的难度不断加大。因此，建立一套简便、快捷、经济、准确的品种真实性和纯度鉴定技术体系是保护育种者的知识产权、打击假冒伪劣种子、规范种子市场和促进我国种子产业参与国际竞争的迫切需要。DNA分子标记反映了 DNA水平上生物个体间的遗传差异，具有数量丰富、多态性高、不受环境影响、检测快速等优点而逐渐得到应用(李召华等，2006)。其中，SSR(simple sequence repeat)标记因为多态性好、重复性高、操作简便，被认为是一种发展前景看好的DNA指纹技术。SSR分子标记是由Moore等于1989年创建的一种基于特异引物PCR技术的分子标记(Moore等，1991)，属于共显性标记，具有多态性丰富，操作简单，重复性好等优点，检测结果准确可靠，重复性好，操作简便、快速，且对DNA数量及质量要求不高，广泛应用于遗传图谱构建、比较基因组研究、遗传多样性分析和种质鉴定等方面，是目前最受欢迎的DNA指纹图谱技术之一。SSR分子标记技术在杂交水稻种子纯度鉴定中的应用，已小范围应用于种子纯度检测实践(李召华等，2006)。彭锁堂等(2003)用引物RM17对杂交稻组合汕优63和两优培九进行了 SSR鉴定；Nandakumar等(2004)利用SSR分子标记成功构建4个水稻品种及其亲本的指纹图谱，并成功用于品种的纯度鉴定。肖小余等(2006)从208对引物中筛选出具有多态性的引物123对，建立了四川省主要杂交水稻亲本的DNA指纹数据库。本研究从DNA提取、PCR反应体系和程序及凝胶电泳等方面进行了技术体系的优化，建立了准确、简单、快速、成本低廉的快速鉴定籼粳交水稻种子纯度的技术体系。
【发明内容】
[0005]本发明提出一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，解决了现有技术中种子真实性和纯度的问题。
[0006]本发明的技术方案是这样实现的:
[0007]一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，包括:
[0008]( I)种子DNA的直接提取(无需发芽)；
[0009](2) PCR 扩增反应；
[0010]所述PCR反应的体系中I对SSR引物有两种选择，一种选择序列为正向引物5，-CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3 ’和反向引物
[0011]5，-GCACAAGGTGAGCAGTCC-3，；
[0012]另一种选择序列为正向引物5’ -CAAAAACAGAGCAGATGAC-3’和反向引物5， -CTCAAGATGGACGCCAAGA-3，；
[0013](3)凝胶电泳检测；
[0014](4)种子纯度计算；
[0015]兼有父母特征主带的种子为目标种子，计数；
[0016]计算公式如下:受检种子批种子纯度(％)=受检种子中兼有父母本特征带型种子数/受检种子总数X100。
[0017]作为优选的技术方案，所述`步骤(1)种子DNA的直接提取的步骤如下:将籼粳交杂交水稻种子剥去稃壳后放入离心管内；在组织磨样机上打磨30s ;先后加入400 μ I提取液和120μ 15mol/L醋酸钾；混匀后在4°C环境下静置10_15min ;25°C下12000rpm离心10min-15min ;取上清，先后加入无水乙醇400 μ I和3mol/L醋酸钠15μ I ;25°C下12000rpm离心10min_15min后去上清；加入400 μ 170%无水乙醇洗漆；4°C下12000rpm离心4min-6min ;倒去上清，晾干后加入100 μ I双蒸水溶解，_20°C保存。
[0018]作为优选的技术方案，所述提取液由lmol/LTris-HCl，5mol/LNaCl，10%十二烷基硫酸钠，0.5mol/L乙二胺四乙二钠盐和双蒸水构成。
[0019]作为优选的技术方案，所述步骤(2)PCR扩增反应的具体步骤如下:在96孔PCR板中分别放入 DNA 模板、Mixed 混合液(DNApolymerasemixture,含 Taq 酶、dNTP 和 Mg2+ 等)、I对SSR引物和双蒸水;先941:变性3min ;再94°C变性30s，55°C退火45s，72。。延伸lmin,30个循环；72°C延伸5min，4°C保存。
[0020]作为优选的技术方案，所述步骤(3)凝胶电泳检测的具体步骤如下:安装玻璃板于电泳槽上；将配置好的胶液摇匀，灌胶，插梳子，等胶凝结后点样；电泳槽中加入缓冲液，110V,电泳大约2h ;下胶后将凝胶浸在染色液中浸染IOmin ;用双蒸水冲洗凝胶两遍，在显影液中显影5min ;用自来水冲洗凝胶两遍后在凝胶电泳成像系统仪中拍照记录。
[0021]作为优选的技术方案，所述电泳槽中缓冲液为1XTBE，由三羟甲基氨基甲烷、硼酸和0.5mol/L乙二胺四乙二钠盐混合而成。
[0022]作为优选的技术方案，所述胶液由5XTBE、40%丙烯酰胺、10%过硫酸铵、四甲基乙二胺、双蒸水混合而成，它们的混合体积比为8: 6: 0.3: 0.024: 26。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0024]图1为籼粳杂交水稻春优84及其亲本的特征谱带。其中，编号1-4为母本特征谱带(80bp)，编号5-28为Fl种子特征谱带(兼有父母本条带80bp和120bp)，编号29-32为父本特征谱带(120bp )。
【具体实施方式】
[0025]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026]实施例1
[0027]一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，包括:
[0028]步骤S1:种子中DNA提取
[0029]1、将离心管编号，从送检样品中随机选取净种子，分别放入离心管内，切勿一管多粒或空管；
[0030]2、力口 入 400ylSDS 提取液，提取液由 lMTris_Hcl60 μ 1，5MNacl40 μ 1，10%SDS80 μ 1,0.5MEDTA80 μ I 和双蒸水 140 μ I 混合而成；
[0031]3、在组织磨样机上打磨30s，加入120 μ 15MKac，摇匀，在冰浴上或者4°C环境下静提 10_15min ；
[0032]4、25°C下 12000 转 /min 离心 15min,取上清；
[0033]5、加入无水乙醇 400μ l，3MNaAcl5y 1，25°C下 12000 转/min 离心 8min ;
[0034]6、轻轻倒掉液体，加入400 μ 170%无水乙醇摇晃洗涤粘附在离心管上的DNA和杂质混合物；
[0035]7、4°C下12000转/min离心5min，倒掉上清，将离心管倒置于纸巾上晾干；
[0036]8、晾干后加入100 μ I双蒸水溶解DNA，置于_20°C保存。
[0037]步骤S2 =PCR扩增反应
[0038]1、反应体系(10 μ I):在96孔PCR板中分别放入I μ IDNA模板、5 μ IMixed混合液(DNApolymerasemixture，含 Taq 酶、dNTP 和 Mg2+等)、0.25 μ ISSR 正向引物、0.25 μ ISSR 反向引物和3.5μ I双蒸水。
[0039]2、引物序列:正向引物5’ -CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3，和反向引物5’ -GCACAAGGTGAGCAGTCC-3’;另一种选择序列为正向引物 5’ -CAAAAACAGAGCAGATGAC-3’ 和反向引物 5’ -CTCAAGATGGACGCCAAGA-3’。
[0040]3、扩增程序:先 94°C变性 3min ;再 94°C变性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 lmin，30个循环；72°C延伸5min，4°C保存。
[0041]步骤S3:凝胶电泳
[0042]1、用酒精用力擦洗玻璃板，干燥后进行组装并安装于电泳槽上；
[0043]2、制胶灌胶:聚丙烯酰胺凝胶的制备时每一块胶胶液由4ml5XTBE、3ml40%丙烯酰胺、150 μ 110%APS、12 μ ITEMED、13ml蒸馏水混合而成。将液体混合后摇匀，立即灌胶，聚合时间40min至Ih ；
[0044]3、电泳槽中加入I XTBE缓冲液，点样1.5-2.5 μ 1，IlOV电泳，大约2h ；
[0045]4、银染:将凝胶浸在置有0.2%AgN03的摇床中lOmin，用双蒸水冲洗凝胶两遍，然后将凝胶浸在显影液(1.5% NaOH, 0.1%甲醛)中浸5min，用自来水冲洗凝胶两遍，拍照记录。
[0046]步骤S4:种子批纯度计算
[0047]按上述方法获得籼粳型杂交水稻及其亲本的特征电泳图谱，兼有父母本特征主带的种子为目标种子，计数，并按以下公式计算纯度:受检种子批种子纯度(％) =受检种子中兼有父母本特征带型种子数/受检种子总数X 100。
[0048]其技术效果是:本发明利用SDS快速提取法直接从籼粳交杂交稻种子中提取DNA，然后利用一对SSR引物对籼粳交父母本及其杂交一代种子DNA进行扩增，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离得到兼有父母本特征条带的杂交一代互补特征谱带。对具有此类特征谱带的种子数计数，并计算种子批纯度。经过连续三年的田间纯度鉴定对比，此方法鉴定结果与田间检验结果无显著差异，详见表1。
[0049]表1
[0050]
【权利要求】
1.一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，包括: (1)种子DNA的直接提取；其中种子无需发芽； (2)PCR扩增反应； 所述PCR反应的体系中I对SSR引物有两种选择，一种选择序列为正向引物5’ -CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3’ 和反向引物
5， -GCACAAGGTGAGCAGTCC-3，； 另一种选择序列为正向引物5’ -CAAAAACAGAGCAGATGAC-3’和反向引物5， -CTCAAGATGGACGCCAAGA-3，； (3)凝胶电泳检测； (4)种子纯度计算； 兼有父母特征主带的种子为目标种子，计数； 计算公式如下:受检种子批种子纯度(％)=受检种子中兼有父母本特征带型种子数/受检种子总数X 100。
2.根据权利要求1所述的一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)种子DNA的直接提取的步骤如下:将籼粳交杂交水稻种子剥去稃壳后放入离心管内；在组织磨样机上打磨30s ;先后加入400 μ I提取液和120 μ 15mol/L醋酸钾；混匀后在4°C环境下静置10_15min ;25°C下12000rpm离心10min-15min ;取上清,先后加入无水乙醇400 μ I和3mol/L醋酸钠15 μ I ;25°C下12000rpm离心10min-15min后去上清；加入400 μ 170%无水乙 醇洗漆；4°C下12000rpm离心4min_6min ;倒去上清，晾干后加入100 μ I双蒸水溶解，_20°C保存。
3.根据权利要求2所述的一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，其特征在于，所述提取液由lmol/LTris-HCl，5mol/LNaCl，10%十二烷基硫酸钠，0.5mol/L乙二胺四乙二钠盐和双蒸水构成。
4.根据权利要求1所述的一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，其特征在于，所述步骤(2)PCR扩增反应的具体步骤如下:在96孔PCR板中分别放入DNA模板、Mixed混合液、I对SSR引物和双蒸水；先94°C变性3min ;再94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin, 30个循环；72°C延伸5min，4°C保存。
5.根据权利要求1所述的一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，其特征在于，所述步骤(3)凝胶电泳检测的具体步骤如下:安装玻璃板于电泳槽上；将配置好的胶液摇匀，灌胶，插梳子，等胶凝结后点样；电泳槽中加入缓冲液，110V，电泳2h ;下胶后将凝胶浸在染色液中浸染IOmin ;用双蒸水冲洗凝胶两遍，在显影液中显影5min ;用自来水冲洗凝胶两遍后在凝胶电泳成像系统仪中拍照记录。
6.根据权利要求1所述的一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，其特征在于，所述电泳槽中缓冲液为1XTBE，由三羟甲基氨基甲烷、硼酸和0.5mol/L乙二胺四乙二钠盐混合而成。
7.根据权利要求6所述的一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，其特征在于，所述胶液由5 X TBE、40%丙烯酰胺、10%过硫酸铵、四甲基乙二胺、双蒸水混合而成，它们的混合体积比为8: 6: 0.3: 0.024: 26ο
【文档编号】C12Q1/68GK103740838SQ201410023390
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月18日 优先权日:2014年1月18日
【发明者】曹栋栋, 阮关海, 阮晓丽, 詹艳, 陈合云 申请人:浙江农科种业有限公司