一种裂谷热病毒rt-lamp的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种裂谷热病毒RT-LAMP的检测方法检测过程中：步骤a，建立如下扩增反应体系：5μl?RNA样品、2.5μl?Bst?DNA聚合酶缓冲液(10x)、1μl?Bst?DNA聚合酶(8U/μl)、1μl?AMV反转录酶(10U/μl)、1μld?NTP(25mmol/μl)、5μl?Betaine(5μmol/μl)、1μl?Mg?SO4(100nmol/μl)、对应于L基因的四条引物各1μl引物浓度为F3与B3：5pmol/μl、BIP与FIP：70pmol/μl、H2O补足至25μl；步骤b，将上述各组分混匀后，在65℃水浴中反应1.5～2h；步骤c，用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，然后观察结果。本发明新型的RT-LAMP技术具有快速灵敏、操作简单，安全性高，价格低廉，不需要特殊仪器设备等优点，特别适用于基层检验检疫机构普及应用，为裂谷热病毒早期诊断提供了一种快速、使用的诊断方法。
【专利说明】—种裂谷热病毒RT-LAMP的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及疾病的组织样品和虫媒早期诊断和监测，尤其涉及一种裂谷热病毒RT-LAMP的检测方法。
【背景技术】
[0002]裂谷热(RiftValley fever,RVF)是由裂谷热病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)引起的，由节肢动物传播的热性、急性的一种人兽共患病，该病对全球其他地区如欧洲、亚洲等的动物和人类健康的构成严重的威胁。在裂谷热感染区，RVF的流行引起家畜的流产和死亡，对家畜造成难以估量的损失，病毒感染人后，临床表现为脑炎、视网膜炎(导致失眠)等症状，个别病例表现为出血热症状。RVFV是一种单股负链RNA病毒，RNA分为L (大)、M (中)、S (小)三个片段，RVFV为布尼安病毒科白蛉热病毒属。通过冷冻电子断层扫描RVFV呈多晶状，呈T = 12正20面体结构。
[0003]在RVF流行地区，通常用临床诊断和两种以上实验室诊断方法对RVFV进行检测。当家畜出现有流产病例，除了考虑RVFV外，这种症状容易和弯曲杆菌病、牛传染性鼻气管炎、蓝舌病、布氏杆菌病等引起的症状相似。RVFV病毒的培养需要在生物安全4级实验室，诊断检测需要在实验室中进行。常用的检测方法如病毒分离，核酸检测和抗体检测。然而病毒分离法时间周期长且费用昂贵，血清学方法主要是ELISA方法，如检测IgM和IgG抗体，但这些试验的结果与白蛉热病毒属的其他血清型有交叉性。核酸检测方法如RT-PCR，多重RT-PCR，实时荧光RT-PCR都已经建立和应用。PCR方法敏感、特异、结果可靠，节省时间，适用于临床确诊，但实验仪器和检测费用较贵，对人员的操作技能也有一定的要求。
[0004]鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本创作。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种裂谷热病毒RT-LAMP的快速检测方法，用以克服上述技术缺陷。
[0006]为实现上述目的，本发明提供一种裂谷热病毒RT-LAMP的检测方法，根据GenBank中登录的裂谷热L片段基因分析其保守序列，采用的RT-LAMP引物序列如下:
[0007]F3:5/ -CCCCCAATAAAGTGAAAATTCC-3'
[0008]B3:5/ -ACATCCCCTAATGATCAGTG-3'
[0009]FIP(Flc+F2):
[0010]5' -TGTTGCACAAGTCCACACAG-GAGACACATGGCATCAGG-3'
[0011]BIP(Blc+B2):
[0012]5' -TCAGATGATG CAAG GAAGTG GA-TTTAG GAGAG GTGAACTCACA-3'
[0013]F2:5/ -GAGACACATGGCATCAGG-3'
[0014]Flc:5/ -TGTTGCACAAGTCCACACAG-3'
[0015]B2:5/ -TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3'[0016]Blc:5/ -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-3'。
[0017]进一步，检测过程中:
[0018]步骤a，建立如下扩增反应体系:5 μ I RNA样品、2.5 μ I Bst DNA聚合酶缓冲液(IOx)、I μ IBst DNA 聚合酶(8U/ μ I)、I μ IAMV 反转录酶(IOU/ μ I)、I μ IdNTP (25mmol/μ 1)、5μ IBetaine (5 μ mol/μ 1)、1μ lMgS04 (IOOnmol/μ I)、对应于 L 基因的四条引物各I μ I 引物浓度为 F3 与 Β3:5pmol/y 1、BIP 与 FIP:70pmol/y 1、H2O 补足至 25 μ I ；
[0019]步骤b，将上述各组分混匀后，在65°C水浴中反应1.5~2h ;
[0020]步骤c，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，然后观察结果。
[0021]与现有技术相比较本发明的有益效果在于:本发明新型的RT-LAMP技术具有快速灵敏、操作简单，安 全性高，价格低廉，不需要特殊仪器等优点，特别适用于基层检验检疫机构普及应用。本发明建立的RT-LAM P方法特异性和敏感性方面不亚于荧光RT-PCR方法，在快速检测方面起到一定的作用。检测RVFV核酸技术能够用于临床诊断、风险评估和风险因子的研究。在符合流行病学的情况下，应用分子生物学技术、血清学技术、病毒分离等诊断技术进行综合检测，这样保证检测结果更加准确和可靠。
【具体实施方式】
[0022]以下结合实施例，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
[0023]本发明参照OIE推荐的RT-PCR方法扩增的靶序列设计RT-LAMP引物，并优化反应条件，建立了一种更加稳定的检测方法。
[0024]根据GenBank中登录的裂谷热L片段基因分析其保守序列，设计RT-LAMP扩增所用引物FIP、BIP、F3、B3由本发明设计。RT-LAMP引物序列如下:
[0025]F3:5/ -CCCCCAATAAAGTGAAAATTCC-3'
[0026]B3:5/ -ACATCCCCTAATGATCAGTG-3'
[0027]FIP(Flc+F2):
[0028]5' -TGTTGCACAAGTCCACACAG-GAGACACATGGCATCAGG-3'
[0029]BIP(Blc+B2):
[0030]5' -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3'
[0031 ] F2:5/ -GAGACACATGGCATCAGG-3'
[0032]FlC:5/ -TGTTGCACAAGTCCACACAG-3'
[0033]B2:5/ -TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3'
[0034]BlC:5/ -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-3'
[0035]在检测过程中:
[0036]步骤a，建立如下扩增反应体系:5μ I RNA样品、2.5 μ IBst DNA聚合酶缓冲液(IOx)、I μ IBstDNA 聚合酶(8U/ μ I)、I μ IAMV 反转录酶(10U/ μ I)、I μ IdNTP (25mmol/μ 1)、5μ I Betaine (5 μ mol/μ 1)、1μ lMgS04 (IOOnmol/μ I)、对应于 L 基因的四条引物各I μ I 引物浓度为 F3 与 Β3:5pmol/y 1、BIP 与 FIP:70pmol/y 1、H20 补足至 25 μ I。
[0037]步骤b，将上述各组分进行混匀后，在65°C水浴中反应1.5~2h ;
[0038]步骤c，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，然后观察结果。
[0039]本发明新型的RT-LAMP技术具有快速灵敏、操作简单，安全性高，价格低廉，不需要特殊仪器等优点，特别适用于基层检验检疫机构普及应用。本发明建立的RT-LAMP方法特异性和敏感性方面不亚于荧光RT-PCR方法，在快速检测方面起到一定的作用。检测RVFV核酸技术能够用于临床诊断、风险评估和风险因子的研究。在符合流行病学的情况下，应用分子生物学技术、血清学技术、病毒分离等诊断技术进行综合检测，这样保证检测结果更加准确和可靠。
[0040]以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落 入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种裂谷热病毒RT-LAMP的检测方法，其特征在于，根据GenBank中登录的裂谷热L片段基因分析其保守序列，采用的RT-LAMP引物序列如下:
F3:5/ -CCCCCAATAAAGTGAAAATTCC-3'
B3:5/ -ACATCCCCTAATGATCAGTG-3'
FIP(Flc+F2):
.5' -TGTTGCACAAGTCCACACAG-GAGACACATGGCATCAGG-3'
BIP(Blc+B2):
.5' -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3'
F2:5' -GAGACACATGGCATCAGG-3'
FlC:5/ -TGTTGCACAAGTCCACACAG-3'
B2:5/ -TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3' BlC:5' -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-3'。
2.根据权利要求1所述的裂谷热病毒RT-LAMP的检测方法，其特征在于，检测过程中: 步骤a，建立如下扩增反应体系:5 μ IRNA样品、2.5 μ IBst DNA聚合酶缓冲液(IOx)、.1 μ IBst DNA 聚合酶(8U/ μ I)、I μ IAMV 反转录酶(10U/ μ I)、I μ IdNTP (25mmol/μ I)、.5 μ IBetaine (5 μ mol/μ 1)、1μ lMgS04 (IOOnmol/μ I)、对应于 L基因的四条引物各 I μ I 引物浓度为 F3 与 Β3:5pmol/y 1、BIP 与 FIP:70pmol/y 1、H2O 补足至 25 μ I ； 步骤b，将上述各组分混匀后，在65°C水浴中反应1.5~2h ; 步骤C，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果。
【文档编号】C12Q1/68GK103952494SQ201410078254
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】王 华, 吴晓东, 徐天刚, 王淑娟, 李林, 王志亮 申请人:中国动物卫生与流行病学中心