一种kras基因突变检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种KRAS基因突变检测试剂盒，包括：带盒盖的盒体、挡板、2个海绵、1个装有蒸馏水的试管、2个装有PCR反应预混液的试管、3个装有KRAS外显子1PCR引物的试管、3个装有KRAS外显子2PCR引物的试管、3个装有KRAS外显子1测序引物的试管、3个装有KRAS外显子2测序引物的试管，本试剂盒结构完全基于一种新的实验方法设计，结构简单合理、使用方便、分区设计使得检测过程不易受污染；本试剂盒在检测KRAS基因第2号外显子突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点；本试剂盒中设置的挡板，使得一个空间变为两个空间，能有效防止试剂交叉等引起的污染，使得实验更准确。
【专利说明】—种KRAS基因突变检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种KRAS基因突变检测试剂盒，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]1)KRAS基因突变在结直肠癌中的临床意义
[0003]近年来，随着人民生活水平的不断提高，饮食习惯和饮食结构的改变以及人口老龄化，我国结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的发病率和死亡率均保持上升趋势。其中，结肠癌的发病率上升尤为显著。大多数患者发现时已属于中晚期。结直肠癌发病率22.1万，死亡率11万，5年生存率63.7%。
[0004]KRAS是EGFR (表皮生长因子受体)信号传导通路中的一个关键的下游调节因子，参与细胞生长的调节，在癌变发生过程中起着重要作用。KRAS基因产物参与了控制基因转录的激酶信号传导路径，从而能调节细胞的生长与分化。KRAS基因的改变使KRAS蛋白发生变化，其结果KRAS蛋白不再具有裂 解GTP分子和释放GTP分子的能力。这样的改变导致这条信号传导路径始终处于“开”通的状态。这种“开”的信号导致细胞的生长和增生。因此KRAS的过度表达与扩增导致持续的细胞增殖，这是肿瘤发生的关键一步。
[0005]西妥昔单抗和帕尼单抗是作用于EGFR的单克隆抗体，可以抑制下游的信号通路传导。2008年6月，美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上CRYSTAL、OPUS等研究了西妥昔单抗联合F0LFIRI和FOLFOX作为转移性结直肠癌的初始治疗作用，结论为:KRAS野生型患者在加用西妥昔单抗治疗后PFS得到了显著改善。若KRAS有突变，则无论单药或联合均不应使用西妥昔单抗或帕尼单抗，因为不仅无效，还增加副反应，浪费金钱。
[0006]2008年10月，KRAS基因检测被写入《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》，专家组强烈推荐所有转移性结直肠癌患者均应进行KRAS基因型检测，原发灶或继发灶组织均可，对于KRAS野生型的患者可考虑进一步检测BRAF分型。
[0007]2010年版中国《结直肠癌诊疗规范》指出:完整的病理报告内容应该包括K-ras基因状态的检测，同时晚期/转移性结直肠癌靶向药物治疗前应检测KRAS。
[0008]2) KRAS基因突变在非小细胞肺癌NSCLC的临床意义
[0009]原发性肺癌(以下简称肺癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一。2012年WHO统计显示，肺癌是我国目前发病率和死亡率第I位的恶性肿瘤。基于肺癌的生物学特性、治疗和预后，WHO将其分为两大类:非小细胞肺癌NSCLC和小细胞肺癌SCLC。其中NSCLC占肺癌的85%以上。虽然治疗肺癌技术有了很大的提高，但5年生存率没有明显改善，而且大多数肺癌患者死于无法控制的远处转移，传统的化疗和放疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的副作用。因此，选择肺癌细胞特异的分子靶点，应用针对该靶点的药物进行治疗，在取得明显疗效的同时又避免对正常细胞的伤害的治疗模式，已经被肿瘤学术界和广大患者所认同和采用。
[0010]EGFR (epidermal growth factor receptor,表皮生长因子受体)是目前用于NSCLC分子靶向治疗的最主要靶点。EGFR受体抑制剂TKI小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor),通过阻断细胞受体的ATP结合位点，阻止下游信号传递而产生抑制肿瘤作用。
[0011] 三种EGFR-TKI (吉非替尼/易瑞沙，厄罗替尼/特罗凯，和凯美钠)是目前用于NSCLC分子靶向治疗的主要药物，但在不同的病人中EGFR-TKI的疗效差异很大。大量临床实验发现，除了 EGFR突变，KRAS突变能帮助NSCLC病人更好的预测吉非替尼疗效；KRAS突变的NSCLC病人用厄洛替尼联合处理后临床预后较差。
[0012]2012年《美国国立癌症综合网络(NCCN)非小细胞肺癌临床实践指南》病理评估原则中明确=KRAS突变和内源性TKI耐药有关，确定KRAS基因状态有助于选择适合TKI治疗的病人。同时指出，KRAS基因状态是NSCLC生存的预后指标，也是EGFR-TKI药物的疗效预测指标；还和顺钼/长春瑞滨化疗疗效相关。
[0013]目前临床检测KRAS基因突变的检测试剂原料配备较多，实验过程较为繁琐，设计的原料种类较多，耗时较长，容易污染，准确性不高，另外冷冻的试剂反复冻融多次会造成试剂失效，所以探索一种检测KRAS基因快速可靠的方法已经成为临床实验不得不解决的问题。
【发明内容】
[0014]本发明所要解决的技术问题是提供一种KRAS基因突变检测试剂盒，本试剂盒结构完全基于一种新的实验方法设计，结构简单合理、使用方便、分区设计使得检测过程不易受污染。
[0015]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种KRAS基因突变检测试剂盒，包括:带盒盖的盒体、挡板、2个海绵、I个装有蒸馏水的试管、2个装有PCR反应预混液的试管、3个装有KRAS外显子IPCR引物的试管、3个装有KRAS外显子2PCR引物的试管、3个装有KRAS外显子I测序引物的试管、3个装有KRAS外显子2测序引物的试管，
[0016]其中，所述挡板置于盒体内，将盒体分成两个部分，所述2个海绵分别置于挡板两侧的盒体内，在海绵上打有容器孔，所述I个装有蒸馏水的试管、2个装有PCR反应预混液的试管、3个装有KRAS外显子IPCR引物的试管、3个装有KRAS外显子2PCR引物的试管置于挡板一侧海绵的容器孔内，所述3个装有KRAS外显子I测序引物的试管、3个装有KRAS外显子2测序引物的试管置于挡板另一侧海绵的容器孔内。
[0017]在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0018]进一步，所述两个海绵中的一个打有9个容器孔，另一个海绵打有6个容器孔。
[0019]进一步，所述容器孔在海绵上平行排列。
[0020]本发明与现有产品相比有如下积极有益的效果:
[0021]本试剂盒完全基于一种新的实验方法设计，结构设计简单合理、使用方便、分区设计使得检测过程不易受污染；
[0022]本试剂盒在检测KRAS基因第2号外显子突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点；
[0023]本试剂盒中设置的挡板，使得一个空间变为两个空间，能有效防止试剂交叉等引起的污染，将所有引物试剂分成两管存储，可以有效减少试剂反复冻融的风险，使得实验更准确。【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为本发明一种KRAS基因突变检测试剂盒的结构示意图；
[0025]附图中，各标号所代表的部件列表如下:
[0026]1、盒体，2、海绵、3、挡板，4、装有蒸馏水的试管，5、装有PCR反应预混液的试管，6、装有KRAS外显子IPCR引物的试管，7、装有KRAS外显子2PCR引物的试管，8、装有KRAS外显子I测序引物的试管，9、装有KRAS外显子2测序引物的试管，10、容器孔。
【具体实施方式】
[0027]以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0028]实施例1
[0029]如图1所示，一种KRAS基因突变检测试剂盒，包括:带盒盖的盒体1、挡板3、2个海绵2、I个装有蒸馏水的试管4、2个装有PCR反应预混液的试管5、3个装有KRAS外显子IPCR引物的试管6、3个装有KRAS外显子2PCR引物的试管7、3个装有KRAS外显子I测序引物的试管8、3个装 有KRAS外显子2测序引物的试管9，
[0030]其中，所述挡板3置于盒体I内，将盒体I分成两个部分，所述2个海绵2分别置于挡板3两侧的盒体I内，在海绵2上打有容器孔10，所述I个装有蒸馏水的试管4、2个装有PCR反应预混液的试管5、3个装有KRAS外显子IPCR引物的试管6、3个装有KRAS外显子2PCR引物的试管7置于挡板3 —侧海绵2的容器孔10内，所述3个装有KRAS外显子I测序引物的试管8、3个装有KRAS外显子2测序引物的试管9置于挡板3另一侧海绵2的容器孔10内。
[0031]所述两个海绵2中的一个打有9个容器孔10，另一个海绵2打有6个容器孔10。
[0032]所述容器孔10在海绵2上平行排列。
[0033]操作方法:
[0034]1、DNA提取:(使用天根公司基因组DNA提取试剂盒，货号DP331)按照提取试剂盒说明书做常规DNA提取，最终DNA的洗脱体积50ul，若DNA当天不使用，则要保存在_20°C。
[0035]2、PCR:将PCR反应预混液、双蒸水及KRAS PCR引物，室温融化并混匀，2000rpm
离心3秒。
[0036]所述PCR反应预混液为2XTaq mix (novoprotein公司，产品货号:E005)
[0037]试剂盒包含2套PCR引物。一套能够扩增KARS基因外显子1，包含12、13密码子在内的片段，另一套能够扩增KARS基因外显子2，包含61密码子在内的片段。每套PCR引物中均有一条引物标记了生物素的引物，它能保证在测序反应中正确分离出待测DNA链。同时，该试剂盒还含有2条不同的测序引物，一条用于12、13密码子，另一条用于61密码子，它们用于后续的焦磷酸序列分析中检测并定量者最常见的3个密码子突变。
[0038]基因KRAS第I外显子的正向引物、反向引物和测序引物:
[0039]F:5/ -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3' (SEQ ID N0.1)；
[0040]R:5/ -GTTGGATCATATTCGTCCACAAA-3' (SEQ ID N0.2)，5'端生物素标记；
[0041]测序引物:5'-AAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3' (SEQ ID N0.5)，检测密码子 12、13 ;[0042]基因KRAS第2外显子的正向引物、反向引物和测序引物:
[0043]F:5/ -CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCAGGATT-3/ (SEQ ID N0.3)；
[0044]R:5/ -AAGAAAGCCCTCCCCAGTCC-3' (SEQ ID N0.4)，5'端生物素标记；
[0045]测序引物:5'-TTGGATATTCTCGACACAGCAGGT-3' (SEQ ID N0.6)，检测密码子 61 ;
[0046]所述基因KRAS外显子IPCR引物和KRAS外显子2PCR引物的浓度均为10 μ mol/L ；
[0047]所述基因KRAS外显子I测序引物和KRAS外显子2测序引物的浓度均为IOymol/L ；
[0048]每个样本需要做两管PCR扩增，体系配制如表1和表2，基因KRAS外显子I和外显子2PCR扩增的总体积均为25ul。
[0049]表1
[0050]
【权利要求】
1.一种KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括:带盒盖的盒体、挡板、2个海绵、I个装有蒸馏水的试管、2个装有PCR反应预混液的试管、3个装有KRAS外显子IPCR引物的试管、3个装有KRAS外显子2PCR引物的试管、3个装有KRAS外显子I测序引物的试管、3个装有KRAS外显子2测序引物的试管， 其中，所述挡板置于盒体内，将盒体分成两个部分，所述2个海绵分别置于挡板两侧的盒体内，在海绵上打有容器孔，所述I个装有蒸馏水的试管、2个装有PCR反应预混液的试管、3个装有KRAS外显子IPCR引物的试管、3个装有KRAS外显子2PCR引物的试管置于挡板一侧海绵的容器孔内，所述3个装有KRAS外显子I测序引物的试管、3个装有KRAS外显子2测序引物的试管置于挡板另一侧海绵的容器孔内。
2.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述两个海绵中的一个打有9个容器孔 ，另一个海绵打有6个容器孔。
3.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述容器孔在海绵上平行排列。
【文档编号】C12M1/34GK103937664SQ201410078862
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月5日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】王彤, 陈大方 申请人:瑞希基因科技（北京）股份有限公司