一种基于壳寡糖修饰具有抗冻功能的鱼皮蛋白多肽复合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于水产品副产物加工领域的一种基于壳寡糖修饰具有抗冻功能的鱼皮蛋白多肽复合物，主要是将鱼皮磨成浆，离心去掉脂肪；接着用超声波处理、复合酶酶解，再对酶解产物离心，取上清液；采用二步超滤上清液，得分子量5000～8000道尔顿的鱼皮蛋白多肽，再与壳寡糖反应，得鱼皮蛋白多肽复合物。本发明还公开了其制备方法和用途。本发明鱼皮蛋白多肽复合物抗冻功能好，可将冷冻干燥微生物的活率提高60%；其次，具有较好的风味，可以改善冰淇淋的组织结构。本发明制备方法利用超声波处理，鱼皮蛋白多肽复合物的得率高；本发明以水产品加工的副产物鱼皮为原料，不仅原料成本低，而且减少了鱼皮作为废物处理的能源消耗和劳动力。
【专利说明】一种基于壳寡糖修饰具有抗冻功能的鱼皮蛋白多肽复合物
【技术领域】
[0001]本发明属于水产品副产物加工领域，具体涉及一种基于壳寡糖修饰具有抗冻功能的鱼皮蛋白多肽复合物，以及该鱼皮蛋白多肽复合物的制备方法。
【背景技术】
[0002]抗冻蛋白具有低温保护功能，抗冻蛋白可作为冷冻保护剂在医学、化妆品、生物、食品、农学等领域有广泛的应用价值。如抗冻蛋白可用于提高特定微生物的抗冻能力，以及减小食品冻减时大冰晶形成和重结晶对食品结构的破坏，改善食品品质。
[0003]1957年，Scholander等首次报道一些海洋鱼类存在具有抗冻活性的蛋白。1969年,Devries和Wohlschlag在南极海洋鱼类的血液中首次提取并证明了具有抗冻活性的物质是蛋白。此后，人们相继对极区鱼类、植物、昆虫、真菌和细菌中的抗冻蛋白进行了研究。从现有的报道来看，鱼类抗冻蛋白的研究主要集中在分离纯化、功能结构特性等方面。由于动植物自身存在的抗冻蛋白数量非常有限，采用传统的分离提纯方法从动植物得到的抗冻蛋白数量十分有限，很难实现规模化生产，难以在农业，生物及医药工业等领域得到广泛应用。
[0004]抗冻蛋白的抗冻活性片段主要存在于局部的特异多肽链结构域，并不是整体蛋白质在起作用(Evans, R.P.等.Biochimicaet Biophysica Acta(BBA)-Proteinsand Proteomics, 2004.1700 (2), 209-217.Fletcher, G.L.等.Annual Reviewof Physiology,2001.63,359-390.Low, ff.K.等.Journal of Biological Chemistry, 2001.276(15), 11582-11589.Wang, S.Y.等.Applied Mechanics andMaterials, 2012.140，411-`415)。国内已有从小麦、沙冬青、牛皮、猪皮、昆虫中提取制备抗冻蛋白的相关专利申请(如 CN200610166427.4，CN201010277569.4，CN200810072986.8，CN201110091198.5，CN201010292036.3)，其中专利申请《一种鱼源抗冻多肽及其制备方法》(申请号为:CN201310441149.9)公开了以鱼皮胶原蛋白为原料，通过木瓜蛋白酶酶解，再经过分离纯化得到纯化的特异性抗冻多肽。国外方面，欧洲专利EP9301969W公开了一种获得抗冻蛋白基因的方法，并利用其在酵母中的表达生产抗冻蛋白多肽，而含有抗冻多肽的酵母可以用在冷冻面团等的生产中。日本专利JP2003142850公开了一些鱼类血中的抗冻蛋白以及它们的氨基酸序列和碱基序列。从上述可以看出，尽管目前有一系列的抗冻蛋白分离提取的方法，但是难以实现规模化的生产。
[0005]经检索，没有发现以鱼皮为原料，通过对鱼皮的超声波预处理，利用复合蛋白酶酶解，再经过与壳寡糖作用制备具有特定抗冻功能的鱼皮蛋白多肽复合物的报道。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于提供一种基于壳寡糖修饰具有抗冻功能的鱼皮蛋白多肽复合物。该鱼皮蛋白多肽复合物具有较好的微生物低温保护作用。
[0007]本发明另一目的在于提供上述鱼皮蛋白多肽复合物的制备方法。[0008]本发明第三目的在于提供上述鱼皮蛋白多肽复合物的用途。
[0009]实现本发明的技术方案如下:
[0010]一种基于壳寡糖修饰具有抗冻功能的鱼皮蛋白多肽复合物，按照如下方法制备:
[0011](I)、将冷冻鱼皮在10~12°C下进行解冻，然后用水将鱼皮清洗干净，再将鱼皮打成浆，得鱼皮浆；接着向鱼皮浆中加入2.0~5.0倍鱼皮浆重量的水，然后利用胶体磨将鱼皮浆磨成鱼皮浆液，再在3000~5000g下离心5~8分钟，去掉上层脂肪，得去脂鱼皮浆液；
[0012](2)、将去脂鱼皮浆液用超声波处理5~10分钟；然后按照0.7~1.0%鱼皮重量的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼皮浆液体中加入复合蛋白酶，在45~55°C、pH7.0~8.0条件下进行酶解反应0.25~1.0小时，然后在85~90°C下保温3~5分钟，冷却至室温；再在3000~5000g条件下离心3~6分钟，收集上清液；
[0013](3)、将步骤(2)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，先用孔径为8000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，留取分子量小于8000道尔顿的多肽；再用孔径为5000道尔顿的膜超滤，将分子量大于5000道尔顿的多肽截留，获得分子量为5000~8000道尔顿的鱼皮蛋白多肽；冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉；
[0014](4)、按照鱼皮蛋白多肽粉和壳寡糖之间质量比为5~7:1的比例将鱼皮蛋白多肽粉和壳寡糖混合，然后溶解于水中，轻轻搅拌5~10分钟，溶液最终浓度为12~15% (w/w);冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽-壳寡糖冻干粉；
[0015](5)、将鱼皮蛋白多肽-壳寡糖冻干粉在65~75°C、相对湿度为76~79%条件下反应12~15小时，得鱼皮蛋白多肽复合物。
[0016]上述鱼皮蛋白多肽复合物步骤(1)中所述的鱼皮来自于河豚鱼或鳕鱼等。
[0017]上述鱼皮蛋白多肽复合物步骤(1)中所述的鱼皮解冻的时间为5~10小时。
[0018]上述鱼皮蛋白多肽复合物步骤(2)中所述的超声波的频率为25~30kH。
[0019]上述鱼皮蛋白多肽复合物步骤(2)中所述的复合蛋白酶由风味蛋白酶和中性蛋白酶组成；其中风味蛋白酶和中性蛋白酶之间的质量比为1:1~2。
[0020]上述鱼皮蛋白多肽步骤(2)中所述的pH用lmol/L的NaOH或HCl来调节。
[0021]上述基于壳寡糖修饰具有抗冻功能的鱼皮蛋白多肽复合物的制备方法，包括如下步骤:
[0022](1)、将冷冻鱼皮在10~12°C下进行解冻，然后用水将鱼皮清洗干净，再将鱼皮打成浆，得鱼皮浆；接着向鱼皮浆中加入2.0~5.0倍鱼皮浆重量的水，然后利用胶体磨将鱼皮浆磨成鱼皮浆液，再在3000~5000g下离心5~8分钟，去掉上层脂肪，得去脂鱼皮浆液；
[0023](2)、将去脂鱼皮浆液用超声波处理5~10分钟；然后按照0.7~1.0%鱼皮重量的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼皮浆液体中加入复合蛋白酶，在45~55°C、pH7.0~8.0条件下进行酶解反应0.25~1.0小时，然后在85~90°C下保温3~5分钟，冷却至室温；再在3000~5000g条件下离心3~6分钟，收集上清液；
[0024](3)、将步骤(2)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，先用孔径为8000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，留取分子量小于8000道尔顿的多肽；再用孔径为5000道尔顿的膜超滤，将分子量大于5000道尔顿的多肽截留，获得分子量为5000~8000道尔顿的鱼皮蛋白多肽；冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉；
[0025](4)、按照鱼皮蛋白多肽粉和壳寡糖之间质量比为5~7:1的比例将鱼皮蛋白多肽粉和壳寡糖混合，然后溶解于水中，轻轻搅拌5~10分钟，溶液最终浓度为12~15% (w/w);冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽-壳寡糖冻干粉；
[0026](5)、将鱼皮蛋白多肽-壳寡糖冻干粉在65~75°C、相对湿度为76~79%条件下反应12~15小时，得鱼皮蛋白多肽复合物。
[0027]上述制备方法步骤(1)中所述的鱼皮来自于河豚鱼或鳕鱼等。
[0028]上述制备方法步骤(1)中所述的鱼皮解冻的时间为5~10小时。
[0029]上述制备方法步骤(2)中所述的超声波的频率为25~30kH。
[0030]上述制备方法步骤(2)中所述的复合蛋白酶由风味蛋白酶和中性蛋白酶组成；其中风味蛋白酶和中性蛋白酶之间的质量比为1:1~2。
[0031]上述制备方法步骤(2)中所述的pH用lmol/L的NaOH或HCl来调节。
[0032]上述基于壳寡糖修饰具有抗冻功能的鱼皮蛋白多肽复合物在微生物抗冻保护上的应用。
[0033]与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果:(I)、本发明基于壳寡糖修饰的鱼皮蛋白多肽抗冻功能好，可以将冷冻干燥微生物的活率提高60%。(2)、本发明采用复合蛋白酶酶解，获得特定分子量的多肽与壳寡糖结合。(3)、本发明制备具有特定抗冻功能的鱼皮蛋白多肽-壳寡糖，适用于工业化生产。(4)、本发明利用频率为25-30kH超声波技术处理鱼皮蛋白浆，鱼皮蛋白多肽的得率高。(5)、本发明采用反应温度较低，反应时间较短，安全性好。(6)、本发明鱼皮蛋 白多肽复合物，具有较好的风味，可以改善冰淇淋的组织结构。
(7)、本发明以水产品加工的副产物鱼皮为原料，不仅原料成本低，而且减少了鱼皮作为废物处理的能源消耗和劳动力。
【具体实施方式】
[0034]实施例1基于壳寡糖修饰具有抗冻功能的河豚鱼鱼皮蛋白多肽复合物的制备
[0035]按照如下方法进行:
[0036](I)、将冷冻河豚鱼鱼皮100克在12°C下进行解冻5小时，然后用水将鱼皮清洗干净，再用打浆机将鱼皮打成浆，得鱼皮浆；接着向鱼皮浆中加入5.0倍鱼皮浆重量的水500克，然后利用胶体磨将鱼皮浆磨成鱼皮浆液，再在5000g下离心5min，去掉上层脂肪，得去脂鱼皮浆液552克。
[0037](2)、将去脂鱼皮浆液于超声波发生器中，用频率为25kH的超声波处理IOminji变鱼皮蛋白的组织结构；然后按照1.0%鱼皮重量的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼皮衆液中加入复合蛋白酶(复合蛋白酶由风味蛋白酶(购自Novozymes,以下同)和中性蛋白酶(购自北京东华强盛生物技术有限公司，以下同)组成，它们之间的质量比为1:1)1.0克，在55°C、pH7.5 (用lmol/L的NaOH或HCl来调节)条件下进行酶解反应1.0小时，在90°C下保温3分钟，冷却至室温，再在3000g条件下离心6分钟，收集上清液470克。
[0038](3)、将步骤(2)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，先用孔径为8000道尔顿的陶瓷膜超滤，留取分子量小于8000的多肽，再用孔径为5000道尔顿的膜将分子量大于5000道尔顿的蛋白截留，获得分子量为5000-8000道尔顿的鱼皮蛋白多肽；冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉6.8克。
[0039](4)、将鱼皮蛋白多肽粉6.8克和壳寡糖(青岛海德贝公司)1.2克混合均匀，然后溶解于水中，轻轻搅拌10分钟，溶液最终浓度为15%(w/w);冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽-壳寡糖冻干粉8.9克。
[0040](5)、将所得的鱼皮蛋白多肽-壳寡糖冻干粉在温度为75°C、空气相对湿度为79%条件下反应12h，得基于壳寡糖修饰的鱼皮蛋白多肽复合物8.8克。
[0041]实施例2基于壳寡糖修饰具有抗冻功能的鳕鱼鱼皮蛋白多肽复合物的制备
[0042]按照如下方法进行:
[0043](I)、将冷冻鳕鱼鱼皮200克在12°C进行解冻7小时，然后用水将鱼皮清洗干净，再用打浆机将鱼皮打成浆，得鱼皮浆。接着向鱼皮浆中加入4.0倍鱼皮浆重量的水800克，然后利用胶体磨将鱼皮浆磨成鱼皮浆液，再在4000g下离心7分钟，去掉上层脂肪，得去脂鱼皮浆液962克。
[0044](2)、将步骤(1)所得的去脂鱼皮浆液于超声波发生器中，经频率为30kH超声波处理6分钟，改变鱼皮蛋白的组织结构。按照0.7%鱼皮重量的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼皮浆液中加入复合蛋白酶(风味蛋白酶和中性蛋白酶组成，它们之间的质量比为I:2) 1.4克，在501:、？!18.0(用lmol/L的NaOH或HCl来调节)条件下进行酶解反应0.5小时，然后在90°C下保温3分钟，冷却至室温；在4000g条件下离心5分钟，收集上清液850克。
[0045](3)、将步骤(2)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，先用孔径为8000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，留取分子量小于8000道尔顿的多肽，再用孔径为5000道尔顿的膜将分子量大于5000道尔顿的多肽截留，获得分子量为5000~8000道尔顿的鱼皮蛋白多肽；冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉13.8g。
[0046](4)、将鱼皮蛋白多肽粉13.8g和壳寡糖2.0g混合均匀，得鱼皮蛋白多肽粉和壳寡糖的混合物；然后溶解于水中，轻轻搅拌lOmin，溶液最终浓度为13%(w/w);冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽-壳寡糖冻干粉15.7g。
[0047](5)、将所得的鱼皮蛋白多肽-壳寡糖冻干粉在70°C、空气相对湿度为79%条件下反应13小时，得鱼皮蛋白多肽复合物15.5克。
[0048]实施例3基于壳寡糖修饰具有抗冻功能的河豚鱼鱼皮蛋白多肽复合物的制备
[0049]按照如下方法进行:
[0050](I)、将冷冻河豚鱼鱼皮300克在12 °C进行解冻9小时，然后用水将鱼皮清洗干净，再用打浆机将鱼皮打成浆，得鱼皮浆；接着向鱼皮浆中加入3.0倍鱼皮浆重量的水900克，然后利用胶体磨将鱼皮浆磨成鱼皮浆液，再在4000g下离心8分钟，去掉上层脂肪，得去脂鱼皮浆液1122克。
[0051 ] (2 )、将将步骤(1)所得的去脂鱼皮浆液于超声波发生器中，经频率为25kH超声波处理8分钟，改变鱼皮蛋白的组织结构；然后按照0.80%鱼皮重量的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼皮浆液体中加入复合蛋白酶(风味蛋白酶和中性蛋白酶组成，它们之间的质量比为1:2)2.4克，在45°C、pH7.5(用lmol/L的NaOH或HCl来调节)条件下进行酶解反应0.25小时，然后在85°C下保温5分钟，冷却至室温；在3000g条件下离心6min，收集上清液920克；[0052](3)、将步骤(2)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，先用孔径为8000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，留取分子量小于8000道尔顿的多肽，再用孔径为5000道尔顿的膜将分子量大于5000道尔顿的多肽截留，获得分子量为5000~8000道尔顿的鱼皮蛋白多肽；冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉20.5克。
[0053](4)、将鱼皮蛋白多肽粉20.5克和壳寡糖3.5克混合均匀，得鱼皮蛋白多肽粉和壳寡糖的混合物；然后溶解于水中，轻轻搅拌8分钟，溶液最终浓度为13% (w/w);冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽-壳寡糖冻干粉23.9克；
[0054](5)、将所得的鱼皮蛋白多肽-壳寡糖冻干粉在65°C、相对湿度为78%条件下反应15小时，得鱼皮蛋白多肽复合物23.7克。
[0055]实施例4本发明鱼皮蛋白多肽复合物对微生物抗冻保护对比试验
[0056]按照如下方法进行:
[0057]试验处理:A.空白对照；B.壳寡糖；C.未进行糖基化修饰的鱼皮蛋白多肽；D.实施例I制备的鱼皮蛋白多肽复合物；E.实施例2制备的鱼皮蛋白多肽复合物；F.实施例3制备的鱼皮蛋白多肽复合物。
[0058]将离心浓缩后的保加利亚乳杆菌(来源中国农业大学，编号:S_5)分别添加不同冻干保护剂后(见处理B-F)(菌体与冻干保护剂的比例为4:1 (v/v)，置于-40°C的冻干机中，待菌液冻结后，于0.01mbar的真空度下冷冻干燥48小时，然后在适当条件下复水，测定菌
体存活率。
[0059]
【权利要求】
1.一种基于壳寡糖修饰具有抗冻功能的鱼皮蛋白多肽复合物，其特征在于按照如下方法制备: (1)、将冷冻鱼皮在10~12°C下进行解冻，然后用水将鱼皮清洗干净，再将鱼皮打成浆，得鱼皮浆；接着向鱼皮浆中加入2.0~5.0倍鱼皮浆重量的水，然后利用胶体磨将鱼皮浆磨成鱼皮浆液，再在3000~5000g下离心5~8分钟，去掉上层脂肪，得去脂鱼皮浆液； (2)、将去脂鱼皮浆液用超声波处理5~10分钟；然后按照0.7~1.0%鱼皮重量的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼皮浆液体中加入复合蛋白酶，在45~55°C、pH7.0~`8.0条件下进行酶解反应0.25~1.0小时，然后在85~90°C下保温3~5分钟，冷却至室温；再在3000~5000g条件下离心3~6分钟，收集上清液； (3)、将步骤(2)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，先用孔径为8000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，留取分子量小于8000道尔顿的多肽；再用孔径为5000道尔顿的膜超滤，将分子量大于5000道尔顿的多肽截留，获得分子量为5000~8000道尔顿的鱼皮蛋白多肽；冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉； (4)、按照鱼皮蛋白多肽粉和壳寡糖之间质量比为5~7:1的比例将鱼皮蛋白多肽粉和壳寡糖混合，然后溶解于水中，轻轻搅拌5~10分钟,溶液最终浓度为12~15% (w/w);冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽-壳寡糖冻干粉； (5)、将鱼皮蛋白多肽-壳寡糖冻干粉在65~75°C、相对湿度为76~79%条件下反应`12~15小时，得鱼皮蛋白多肽复合物。
2.按照权利要求1所述的鱼皮蛋白多肽复合物，其特征在于其步骤(1)中所述的鱼皮来自于河豚鱼或鳕鱼。
3.按照权利要求1所述的鱼皮蛋白多肽复合物，其特征在于其步骤(1)中所述的鱼皮解冻的时间为5~10小时。
4.按照权利要求1所述的鱼皮蛋白多肽复合物，其特征在于其步骤(2)中所述的超声波的频率为25~30kH。
5.按照权利要求1所述的鱼皮蛋白多肽复合物，其特征在于其步骤(2)中所述的复合蛋白酶由风味蛋白酶和中性蛋白酶组成；其中风味蛋白酶和中性蛋白酶之间的质量比为1:1 ~2。
6.权利要求1所述的鱼皮蛋白多肽复合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)、将冷冻鱼皮在10~12°C下进行解冻，然后用水将鱼皮清洗干净，再将鱼皮打成浆，得鱼皮浆；接着向鱼皮浆中加入2.0~5.0倍鱼皮浆重量的水，然后利用胶体磨将鱼皮浆磨成鱼皮浆液，再在3000~5000g下离心5~8分钟，去掉上层脂肪，得去脂鱼皮浆液； (2)、将去脂鱼皮浆液用超声波处理5~10分钟；然后按照0.7~1.0%鱼皮重量的重量百分比比例向经过超声波处理的鱼皮浆液体中加入复合蛋白酶，在45~55°C、pH7.0~`8.0条件下进行酶解反应0.25~1.0小时，然后在85~90°C下保温3~5分钟，冷却至室温；再在3000~5000g条件下离心3~6分钟，收集上清液； (3)、将步骤(2)所得的上清液通过二步超滤方法进行处理，先用孔径为8000道尔顿的陶瓷膜超滤，取滤过液，留取分子量小于8000道尔顿的多肽；再用孔径为5000道尔顿的膜超滤，将分子量大于5000道尔顿的多肽截留，获得分子量为5000~8000道尔顿的鱼皮蛋白多肽；冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽粉；(4)、按照鱼皮蛋白多肽粉和壳寡糖之间质量比为5~7:1的比例将鱼皮蛋白多肽粉和壳寡糖混合，然后溶解于水中，轻轻搅拌5~10分钟,溶液最终浓度为12~15% (w/w);冷冻干燥，得鱼皮蛋白多肽-壳寡糖冻干粉； (5)、将鱼皮蛋白多肽-壳寡糖冻干粉在65~75°C、相对湿度为76~79%条件下反应12~15h，得鱼皮蛋白多肽复合物。
7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)中所述的鱼皮来自于河豚鱼或鳕鱼。
8.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)中所述的鱼皮解冻的时间为5~IOh ;所述的超声波的频率为25~30kH。
9.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于其步骤(2)中所述的复合蛋白酶由风味蛋白酶和中性蛋白酶组成；其中风味蛋白酶和中性蛋白酶之间的质量比为1:1~2。
10.权利要 求1~5任一所述的的鱼皮蛋白多肽复合物在微生物抗冻保护上的应用。
【文档编号】C12N1/04GK103820516SQ201410078719
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月5日 优先权日:2014年3月5日
【发明者】余训培 申请人:台州天和水产食品有限公司