一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法
【专利摘要】本发明公开一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法。即以酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）CGMCCNo.2.630为菌种，以蓖麻油为底物，外加猪胰脂肪酶，在有氧条件下，通过批发酵或分批补料发酵的方法制备γ-癸内酯，本发明的天然香料γ-癸内酯的发酵方法降低了蓖麻油转化天然γ-癸内酯的转化周期、提高了蓖麻油转化天然γ-癸内酯的转化率及最终产物γ-癸内酯的产率，蓖麻油的生物转化周期仅为12h～30h、蓖麻油转化率可达95%，γ-癸内酯的生物合成效率可达94.9%，特别是本发明在5L发酵罐上，最终的γ-癸内酯的产率，批发酵可达4.81g/L，分批补料发酵可达6.50g/L。
【专利说明】一种天然香料Y-癸内酯的发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种天然香料Y-癸内酯的发酵方法，特别涉及一种采用可代谢蓖麻油为Y-癸内酯的，本实验室购买的菌种，该菌种现保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)为酿酒酵母iSaccharomyces cereFisiae), CGMCC编号为cgmcc 2.630,并通过与外加猪膜脂肪酶的协同作用来进行发酵，生物发酵制备天然香料Y -癸内酯的方法。
【背景技术】
[0002]Y-癸内酯(Y-decalactone,⑶L)在标准大气压下沸点为281°C,为无色至淡黄色澄清液体呈愉快桃子和椰子香气，易溶于有机溶剂。Y -癸内酯不仅存在于桃子，椰子，芒果等水果中，也是乳制品的特征呈味物质之一，迄今为止已经在上百种食物的香气成份中发现了 Y-癸内酯。
[0003]天然Y-癸内酯以其诱人的香气和低香气阈值(水中0.08mg/kg)特征广泛应用于日用香精和食用香精中。在成熟的果子中，含量约为15ppb，其中89%是(R)-异构体，11%是(S)-异构体，研究表明左旋的S型Y-癸内酯香气较为柔和，有令人愉悦的椰奶味香气特征。右旋R型Y-癸内酯为强烈的酯甜水果味类似椰子味。
[0004]天然Y-癸内酯除源于植物、果实提取，采用微生物转化或发酵的方法成为极具工业化前景的技术手段，目前天然Y-癸内酯采用的原料多选用廉价易得的蓖麻油，辅助碳源一般采用葡萄糖或蔗糖等糖类物质。在该生物发酵体系中，蓖麻油一般作为油相存在于水相，易形成水包油现象。单独依靠酵母菌自身完成解脂化效果差，从而进一步影响酵母菌合成Y-癸内酯代谢反应中的 β氧化过程和内酯化过程，造成产物的生物转化周期长，一般为60~200h、蓖麻油转化不完全，其转化率为10~80%，并且最终产物Y-癸内酯的生物合成效率低，仅为60%左右等不良结果。因此，消除蓖麻油转化过程瓶颈，需要对解脂化过程、β氧化过程和内酯化过程进行高度协调，从而达到目标产物Y-癸内酯的高效转化。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了解决上述的生物发酵生产Y -癸内酯过程中，蓖麻油的生物转化周期长、蓖麻油转化不完全以及最终产物Y-癸内酯的生物合成效率低等技术问题而提供了一种天然香料Y-癸内酯的发酵方法，即以酿酒酵母cerevisiae)为菌种，加入外源性猪胰脂肪酶进行偶联反应的转化方式，以提高蓖麻油的解脂过程，从而降低蓖麻油的生物转化周期，本发明的蓖麻油的生物转化周期仅为12~30h、蓖麻油转化率可达95.0%，最终产物Y -癸内酯的生物合成效率可达94.9%。
[0006]本发明的技术方案
一种天然香料Y-癸内酯的发酵方法，即以酿酒酵母CGMCC N0.2.630为菌种，以蓖麻油为底物，外加猪胰脂肪酶，在有氧的条件下，通过批发酵或分批补料发酵的方法得到天然香料Y-癸内酯；
所述的批发酵或分批补料发酵具体包括如下步骤:
(1)、菌种的选取
即以酿酒酵母{Saccharomyces cerevisiae )为菌种，其保藏编号为CGMCC N0.2.630 ；
(2)、培养基配制
①、斜面培养基
所述的斜面培养基按每升计算，由IOg葡萄糖、12g酵母膏、IOg黄豆饼粉、4gNaCl、5gCaC03、20g琼脂和余量的去离子水组成，pH自然,0.1 MPa,即121°C灭菌30min备用；
②、种子培养液培养基
按每升计算，由1.0g的蓖麻油、20g的葡萄糖、1.5g的(NH4)2HP04、3.2g的KH2PO4U.5g的K2HPO4.3Η20、4.0g的MgSO4.7H20、3.0g的NaCl,15.0g的酵母膏和余量的水组成，pH自然
③、发酵培养基
所用发酵培养基按每升计算，由10~30g的蓖麻油、0.1~20g的葡萄糖、0.1~3.5g的(NH4) 2ΗΡ04、0.5 ~3.0g 的 ΚΗ2Ρ04、0.I ~2.5g 的 K2HPO4.3Η20、0.5 ~3.0g 的 MgSO4.7Η20、1.0~7.0g的NaCl、l~20g的酵母膏、0.1~2.0g的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然； ④、发酵过程所用的补料培养基
发酵过程所用的补料培养基为蓖麻油，其用量按其与发酵培养基重量比计算，即发酵过程所用的补料培养基为发酵培养基的0.1~2.0% ；
(3)、斜面种子培养
往茄子瓶中装入40mL斜面培养基，0.1MPaJP 121°C灭菌30 min，冷却至室温，用消毒好的移液器从保存的酿酒酵母CGMCC N0.2.630甘油管中取2mL液体菌，在斜面培养基上划线接种，28 °C培养24~32h得斜面菌；
(4)、摇瓶种子培养
将步骤(3)所得的斜面菌，用消毒好的接种铲取lcm*2cm大小接种至装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，置于摇床上控制转速为200-300r/min，温度为28°C培养24h得到种子液；
(5)、发酵罐培养
按2%接种量将步骤(4)所得的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在有氧条件下进行批发酵或分批补料发酵；
所述的批发酵，即控制转速为200-800r/min，温度28~36°C，优选为30°C，pH自然，培养10~30h，发酵结束；
所述的分批补料发酵，即控制转速为200-800r/min，温度控制在28~36°C，优选为30°C，pH自然，培养10~18h后，无菌状态下一次性加入补料培养基，继续控制转速200-800r/min，温度在28~36°C，优选为30°C，再培养8~18h，发酵结束；
所述的有氧条件下，即发酵过程中控制通气速率与发酵液体积的比为0.3-1.5V/V.min。[0007]上述发酵结束后，按体积比计算，即发酵液:乙酸丁酯为1:1的比例向所得的发酵液加入乙酸丁酯后，旋转震荡lmin，然后以4000r/min离心10min，取上清有机相，用
0.22 μ m的有机相滤膜过滤，然后用气相色谱测定天然香料Y -癸内酯。
[0008]本发明的有益效果
本发明的一种天然香料Y-癸内酯的发酵方法，由于以酿酒酵母cerevisiae) CGMCC N0.2.630为菌种，加入外源性猪胰脂肪酶进行偶联反应的转化方式，从而提高了蓖麻油的解脂过程，从而降低了蓖麻油转化天然Y-癸内酯的转化周期、提高了蓖麻油转化天然Y-癸内酯的转化率及最终产物的Y-癸内酯的产率，蓖麻油的生物转化周期仅为12h~30h、蓖麻油转化率可达95.0%，最终产物Y-癸内酯的生物合成效率可达94.9%，特别是本发明在5L发酵罐上发酵20h结束后，最终的Y-癸内酯的产率批发酵可达 4.81g/L。
[0009]进一步，采用本发明的一种天然香料Y-癸内酯的发酵方法，以分批补料发酵控制的方式，Y-癸内酯的产量比批发酵提高了 35.1%，最终的Y-癸内酯产率在5L发酵罐上达到 6.50g/L。
[0010]进一步，本发明的一种天然香料Y-癸内酯的发酵方法与产物Y-癸内酯的原位分离技术联合使用，亦可有效解除产物Y-癸内酯对体系产生的抑制，进一步提高Y-癸内
酯的产量。
[0011]综上所述，本发明的一种天然香料Y-癸内酯的发酵方法，偶联外源性猪胰脂肪酶添加，将酵母菌发酵Y-癸内酯的解脂反应、β-氧化和内酯化反应高效关联，经过多批实验证实了该方法的可行性和稳定性。此外，本发明的天然香料Y-癸内酯的发酵方法，其操作可控性强，生产成本低，具有良好的工业化应用前景。
【具体实施方式】
[0012]下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
[0013]1、本发明的各实施例中发酵所用的种子液通过如下方式获得:
(1)、斜面种子培养
往茄子瓶中装入40 mL斜面培养基，0.1MPa，即121°C灭菌30 min，冷却至室温，用消毒好的移液器从保存的酿酒酵母CGMCC N0.2.630甘油管中取2mL液体菌，在斜面培养基上划线接种，28 °C培养24~32h得斜面菌；
所述的斜面培养基按每升计算，由IOg葡萄糖、12g酵母膏、IOg黄豆饼粉、4gNaCl、5gCaC03、20g琼脂和余量的去离子水组成，pH自然,0.1MPa,即121°C灭菌30min备用；
(2)、发酵所用种子液的制备
将所得的斜面菌，用消毒好的接种铲取lcm*2cm大小的斜面菌接种至装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，置于摇床上控制转速为200-300r/min，温度为28°C培养24h得到种子液；
所述的 种子培养基按每升计算，由1.0g的蓖麻油、20g的葡萄糖、1.5g的(NH4)2ΗΡ04、3.2g 的 KH2PO4U.5g 的 K2HPO4.3Η20、4.0g 的 MgSO4.7Η20、3.0g 的 NaCl ,15.0g 的酵母膏和余量的水组成，pH自然。
[0014]2、本发明的各实施例中所得的发酵液中Y-癸内酯的含量采用气相分析法，所用仪器为气相色谱仪，即安捷伦6890N，美国安捷伦科技有限公司生产，色谱柱为HP-5柱(30mX0.32ImmX0.25 μ m)；
分析步骤如下:
所得的发酵液加入1:1的乙酸丁酯旋转震荡Imin然后进行离心，4000r/min，离心lOmin，离心后的上清液再用0.22μπι有机相微孔滤膜过滤处理，所得的滤液用于分析；分析条件为:
进样口 T: 250 0C ;检测器T:300°C ;进样量:0.1yL ;分流比:30:1 ;色谱柱N2恒流:
0.8mL/min ;程序升温:100°C保持2min后以20°C /min速率升温到205°C，然后以4°C /min升高到215°C，然后以20°C /min升高的280°C，保持2min。
[0015]3、蓖麻油转化率=转化的蓖麻油的量/原料的总量*100%
Y-癸内酯的生物合成效率=Y-癸内酯实际生成量/ Y -癸内酯理论生成量*100% 实施例1
摇瓶发酵培养基按每升计算，其由20g的蓖麻油、IOg的葡萄糖、10.0g的酵母膏、0.1g的(NH4)2HPO4^0.5g 的 KH2PO4,2.5g 的 K2HPO4.3H20、1.2g 的 MgSO4.7Η20、7.0g 的 NaCU0.1g的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然。
[0016]将上述的装有摇瓶发酵培养基的摇瓶于121°C高压蒸汽灭菌20min后，于无菌室中在温度为25°C下接入2%种子液，摇瓶为250mL，装液量为20%，然后于摇床上，控制温度为32°C，转速为200r/min进行发酵培养，恒温培养30h后发酵结束。
[0017]发酵结束后，按体积比计算，即发酵液:乙酸丁酯为1:1的比例向所得的发酵液加入乙酸丁酯后，旋转震荡lmin,然后以4000r/min离心10min,取上清有机相,用0.22 μ m的有机相滤膜过滤，然后用气相色谱测定天然香料Y -癸内酯。
[0018]上述摇瓶发酵结束后所得的发酵液中的Y-癸内酯的含量经气相色谱分析，结果表明，发酵液中天然香料Y-癸内酯的产量为1.69g/L。
[0019]实施例2
摇瓶发酵培养基按每升计算，其由IOg的蓖麻油、20g的葡萄糖、20g的酵母膏、3.5g的(NH4)2HPO4'3.0g 的 KH2PO4U.2g 的 K2HPO4.3H20、3.0g 的 MgSO4.7H20、3.5g 的 NaCl,2.0g 的脂肪酶和余量的水组成，PH自然。
[0020]将上述的装有摇瓶发酵培养基的摇瓶于121°C高压蒸汽灭菌20min后，于无菌室中在温度为25°C的条件下接入2%种子液，摇瓶为250mL，装液量为20%，然后于摇床上，控制温度为36°C，转速为300r/min，恒温培养30h后发酵结束。
[0021]发酵结束后，按体积比计算，即发酵液:乙酸丁酯为1:1的比例向所得的发酵液加入乙酸丁酯后，旋转震荡lmin,然后以4000r/min离心10min,取上清有机相,用0.22 μ m的有机相滤膜过滤，然后用气相色谱测定天然香料Y -癸内酯。
[0022]上述摇瓶发酵结束后所得的发酵液中的Y -癸内酯的含量经气相色谱分析，结果表明，发酵液中天然香料Y-癸内酯的产量为1.51.g/L。
[0023]实施例3
摇瓶发酵培养基按每升计算， 其由30g的蓖麻油、0.1g的葡萄糖、Ig的酵母膏、1.5g的(NH4)2HPO4U.5g 的 ΚΗ2Ρ04、0.Ig 的 K2HPO4.3Η20、0.5g 的 MgS04.7H20、1.0g 的 NaClU.5g 的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然。[0024]将上述的装有摇瓶发酵培养基的摇瓶于121°C高压蒸汽灭菌20min后，于无菌室中在温度为25°C条件下按接入2%种子液，摇瓶为250mL，装液量为20%，然后于摇床上，控制温度为30°C，转速为250r/min进行发酵培养，恒温培养30h后发酵结束。
[0025]发酵结束后，按体积比计算，即发酵液:乙酸丁酯为1:1的比例向所得的发酵液加入乙酸丁酯后，旋转震荡lmin,然后以4000r/min离心10min,取上清有机相,用0.22 μ m的有机相滤膜过滤，然后用气相色谱测定天然香料Y -癸内酯。
[0026]上述摇瓶发酵结束后所得的发酵液中的Y -癸内酯的含量经气相色谱分析，结果表明，发酵液中天然香料Y-癸内酯的产量为2.15g/L。
[0027]实施例4
摇瓶发酵培养基按每升计算，其由15g的蓖麻油、5.8g的葡萄糖、Ig的酵母膏、1.5g的(NH4)2HPO4,2.4g 的 ΚΗ2Ρ04、0.8g 的 K2HPO4.3Η20、0.9g 的 MgS04.7H20、1.0g 的 NaClU.5g 的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然。
[0028]将上述的装有摇瓶发酵培养基的摇瓶于121°C高压蒸汽灭菌20min后，于无菌室中在温度为25°C条件下按接入2%种子液，摇瓶为250mL，装液量为20%，然后于摇床上，控制温度为28°C，转速为200r/min进行发酵培养，恒温培养30h后发酵结束。
[0029]发酵结束后，按体积比计算，即发酵液:乙酸丁酯为1:1的比例向所得的发酵液加入乙酸丁酯后，旋转震荡lmin,然后以4000r/min离心10min,取上清有机相,用0.22 μ m的有机相滤膜过滤，然后用气相色谱测定天然香料Y -癸内酯。
[0030]上述摇瓶发酵结束后所得的发酵液中的Y -癸内酯的含量经气相色谱分析，结果表明，发酵液中天然香料Y-癸内酯的产量为2.32g/L。
[0031]实施例5
摇瓶发酵培养基按每升计算，其由15g的蓖麻油、0.1g的葡萄糖、Ig的酵母膏、1.5g的(NH4)2HPO4U.5g 的 ΚΗ2Ρ04、0.Ig 的 K2HPO4.3Η20、0.5g 的 MgSO4.7H20、1.0g 的 NaCU0.9g 的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然。
[0032]将上述的装有摇瓶发酵培养基的摇瓶于121°C高压蒸汽灭菌20min后，于无菌室中在温度为25°C条件下按接入2%种子液，摇瓶为250mL，装液量为20%，然后于摇床上，控制温度为30°C，转速为250r/min进行发酵培养，恒温培养30h后发酵结束。
[0033]发酵结束后，按体积比计算，即发酵液:乙酸丁酯为1:1的比例向所得的发酵液加入乙酸丁酯后，旋转震荡lmin,然后以4000r/min离心10min,取上清有机相,用0.22 μ m的有机相滤膜过滤，然后用气相色谱测定天然香料Y -癸内酯。
[0034]上述摇瓶发酵结束后所得的发酵液中的Y -癸内酯的含量经气相色谱分析，结果表明，发酵液中天然香料Y-癸内酯的产量为3.00g/L。
[0035]对照实施例
摇瓶发酵培养基按每升计算，其由15g的蓖麻油、0.1g的葡萄糖、Ig的酵母膏、1.5g的(NH4)2HPO4U.5g 的 ΚΗ2Ρ04、0.Ig 的 K2HPO4.3Η20、0.5g 的 MgSO4.7H20、1.0g 的 NaCUOg 的猪胰脂肪酶和余量的水组成，PH自然。
[0036]将上述的装有摇瓶发酵培养基的摇瓶于121°C高压蒸汽灭菌20min后，于无菌室中在温度为25°C的条件下接入2%种子液，摇瓶为250mL，装液量为20%，然后于摇床上，控制温度为30°C，转速为250r/min，恒温培养30h后发酵结束。[0037]发酵结束后，按体积比计算，即发酵液:乙酸丁酯为1:1的比例向所得的发酵液加入乙酸丁酯后，旋转震荡lmin,然后以4000r/min离心10min,取上清有机相,用0.22 μ m的有机相滤膜过滤，然后用气相色谱测定天然香料Y -癸内酯。
[0038]上述摇瓶发酵结束后所得的发酵液中的Y -癸内酯的含量经气相色谱分析，结果表明，发酵液中天然香料Y-癸内酯的产量为0.60g/L。
[0039]上述实施例1、2、3、4、5中的发酵培养基中分别添加了不同含量的猪胰脂肪酶，而对照实施例的发酵培养基中没有添加猪胰脂肪酶，通过最终发酵液中的天然香料Y -癸内酯的产量进行对比，具体见下表:
【权利要求】
1.一种天然香料Y-癸内酯的发酵方法，其特征在于以酿酒酵母cerevisiae) CGMCC N0.2.630为菌种，以蓖麻油为底物，外加猪胰脂肪酶，在有氧的条件下，通过批发酵或分批补料发酵的方法生成天然香料Y-癸内酯； 上述的批发酵或分批补料发酵的方法中: 所用发酵培养基按每升计算，由10~30g的蓖麻油、0.1~20g的葡萄糖、0.1~.3.5g 的(NH4) 2ΗΡ04、0.5 ~3.0g 的 ΚΗ2Ρ04、0.I ~2.5g 的 K2HPO4.3Η20、0.5 ~3.0g 的MgSO4.7Η20、1.0~7.0g的NaClU~20g的酵母膏、0.1~2.0g的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然; 所用补料培养基为蓖麻油，其用量按其与发酵培养基重量比计算，即发酵过程所用的补料培养基为发酵培养基的0.1~2.0% ； 所述的批发酵或分批补料发酵的方法，其发酵过程中，控制参数如下: 批发酵控制转速为200-800r/min，温度28~36°C，pH自然，培养10~30h，发酵结束； 分批补料发酵控制转速为200-800r/min，温度控制在28~36°C，pH自然，培养12~.30h后，一次性在无菌状态下加入0.1~2.0%的蓖麻油，继续控制转速为200-800r/min，温度在28~36 °C，再培养8~18h，发酵结束。
2.如权利要求1所述的一种天然香料Y-癸内酯的发酵方法，其特征在于所述的批发酵或分批补料发酵具体包括如下步骤: (1)、菌种的选取 即以酿酒酵母cereFisiae),保藏编号为CGMCC N0.2.630的甘油管为囷种； (2)、培养基配制 ①、斜面培养基 所述的斜面培养基按每升计算，由IOg葡萄糖、12g酵母膏、IOg黄豆饼粉、4gNaCl、5gCaC03、20g琼脂和余量的去离子水组成，pH自然,0.1 MPa,即121°C灭菌30min备用； ②、种子培养基 所述的种子培养基，按每升计算，由1.0g的蓖麻油、20g的葡萄糖、1.5g的(NH4)2ΗΡ04、.3.2g 的 KH2PO4U.5g 的 K2HPO4.3Η20、4.0g 的 MgSO4.7Η20、3.0g 的 NaCl ,15.0g 的酵母膏和余量的水组成，pH自然； ③、发酵培养基 所述的发酵培养基，按每升计算，由10~30g的蓖麻油、0.1~20g的葡萄糖、0.1~.3.5g 的(NH4) 2ΗΡ04、0.5 ~3.0g 的 ΚΗ2Ρ04、0.I ~2.5g 的 K2HPO4.3Η20、0.5 ~3.0g 的MgSO4.7Η20、1.0~7.0g的NaClU~20g的酵母膏、0.1~2.0g的猪胰脂肪酶和余量的水组成，pH自然; ④、发酵过程所用的补料培养基 发酵过程所用的补料培养基为蓖麻油，其用量按其与发酵培养基重量比计算，即发酵过程所用的补料培养基为发酵培养基的0.1~2.0% ； (3)、斜面种子培养 往茄子瓶中装入40mL斜面培养基，0.1MPaJP 121°C灭菌30 min，冷却至室温，用消毒好的移液器从保存的酿酒酵母焊Ce1S cerevisiae、CGMCC N0.2.630甘油管中取2mL液体菌，在斜面培养基上划线接种，28 °C培养24~32h得斜面菌； (4)、摇瓶种子培养 将步骤(3)所得的斜面菌，用消毒好的接种铲取lcm*2cm大小的斜面菌接种至装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，置于摇床上控制转速为200_300r/min，温度为28°C培养24h得到种子液； (5)、发酵罐培养 按2%接种量将步骤(4)所得的种子液接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在有氧条件下进行批发酵或分批补料发酵； 所述的批发酵，控制转速为200-800r/min，温度28~36°C，pH自然，培养10~30h发酵结束； 所述的分批补料发酵，控制转速为200-800r/min，温度控制在28~36°C，pH自然，培养10~30h后，在无菌状态下一次性加入补料培养基后，继续控制转速为200-800r/min，温度在28~36°C，再培养8-18h，发酵结束。
3.如权利要求1或2所述的一种天然香料Y-癸内酯的发酵方法，其特征在于所述的有氧条件下，即发酵过程控制通气速率与发酵液体积的比为0.3-1.5V/V.min。
4.如权利要求1或2所述的一种天然香料Y-癸内酯的发酵方法，其特征在于步骤(5)所述的批发酵，控制转速为200-800r/min，温度控制在28~36°C，pH自然，培养10~30h，发酵结束； 所述的分批补料发酵，控·制转速为200-800r/min，温度控制在28~36°C，pH自然，培养10~30h后，在无菌状态下一次性加入补料培养基后，继续控制转速为200-800r/min，温度28~36°C，再培养8~18h，发酵结束。
【文档编号】C12P17/04GK103849661SQ201410088627
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2014年3月12日
【发明者】荣绍丰, 曹顺利, 蔡宝国, 管世敏, 李茜茜 申请人:上海应用技术学院