一种检测环境中多环芳烃化学物的质粒及应用的制作方法
【专利摘要】本发明为一种检测环境中多环芳烃化学物的质粒及应用，涉及分子生物学及环境生物【技术领域】。本发明通过提取人源性AHR基因启动子，以含萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶双报告基因的CV060质粒为载体，插入特定序列的AHR基因启动子，构建了含AHR基因启动子的内参内置型双荧光素酶报告基因的重组慢病毒质粒。本发明的检测方法重复性好、灵敏度高、检测结果可靠，且操作简单方便，可广泛地应用于环境中多环芳烃类物质的检测。
【专利说明】一种检测环境中多环芳烃化学物的质粒及应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及分子生物学及环境生物【技术领域】，具体地说，是涉及一种含人源性AHR基因启动子及双荧光素酶报告基因的重组质粒的构建方法，从而应用于环境中多环芳烃的存在及含量的检测。
【背景技术】:
[0002]多环芳经化合物(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,简称PAHs)是指分子中含有两个或两个以上苯环的一类碳氢化合物，主要来源于煤炭、石油、木材等有机物的裂解和不完全燃烧。目前已知的PAHs约有200种，广泛分布于人类生活的环境中。PAHs引起的环境污染越来越受到人们的重视，它已成为许多国家的优先监测物。1976年EPA列出了 16项PAHs为优先控制污染物。1990年我国提出的68种水体优先控制污染物中有7种属于PAHs0多数的PAHs有致癌性，流行病学研究表明PAHs通过皮肤、呼吸道、消化道等均可被人体吸收，可诱发皮肤癌、肺癌、直肠癌、膀胱癌、白血病等(BoffettaP, JourenkovaN, Gustavsson P.Cancer risk from occupational and environmental exposure to polycyclicaromatic hydrocarbons.Cancer Causes Control, 1997, 8 (3):444-472.)D 一些 PAHs 还有免疫毒性、生殖和发育毒性。值得注意的是，绝大多数PAHs在体内的代谢产物，其致突变性和致癌性较之原型化学物强数十至数千倍，对人体造成的危害更为严重。
[0003]PAHs毒性作用的机理为，PAHs可诱导机体细胞内芳香烃受体(AHR)的表达，同时作为配体与AHR 结合使之激活，转位于核内后与核中的芳香烃受体核转位子蛋白(ARNT)结合，形成配体-AHR-ARNT复合体，然后结合于特异基因上游的芳香烃受体反应元件(AhRE)，从而导致特异基因如细胞色素P4501A1和1A2等的表达增强，最终通过代谢活化产生毒性作用。由此可见，PAHs类化合物的毒性大小与其诱导AHR能力及活化受体结合AhRE的能力有密切相关性，因此测定PAHs类化学物诱导AHR的能力对于评估其毒性及环境浓度具有主要的参考价值。
[0004]如何高效、快速地检测环境中的PAHs受到了国内外政府部门及相关科研工作者的关注。目前，环境中的PAHs的检测方法主要为化学和生物两大类方法:前者如分光光度法及色谱法，仪器设备大型昂贵、样本前处理复杂，且无法检测未知污染物；后者如细胞增殖实验等，过程繁琐、耗时长、且对操作人员有较高的技术要求，并且上述两种方法都不能准确表达该环境污染物的人体效应。本发明针对现有技术的不足，提供了一种简单、快速、灵敏的检测手段。PAHs进入人体后，激活芳烃受体(AHR)，启动一系列下游生物学效应，从而发挥毒作用效应，因此，利用人源性AHR启动子构建的质粒检测环境中的PAHs，可优于直接的化学检测或简单的细胞增殖，反映化学物存在的同时，还能提示该类化合物对人类健康的潜在的损害效应。
[0005]本发明针对现有技术的不足，提供了一种简单、快速、灵敏的检测手段。PAHs进入人体后，激活芳烃受体(AHR)，启动一系列下游生物学效应，从而发挥毒作用效应，因此，利用人源性AHR启动子构建的质粒检测环境中的PAHs，可优于直接的化学检测或简单的细胞增殖，反映化学物存在的同时，还能提示该类化合物对人类健康的潜在的损害效应。
【发明内容】
:
[0006]本发明的目的在于提供一种含人源性AHR基因启动子及双荧光素酶报告基因的重组慢病毒质粒及其构建方法，从而应用于环境中多环芳烃类物质的检测。
[0007]本发明通过以下技术方案实现上述目的:
[0008]本发明利用人源性AHR基因启动子受到多环芳烃类物质上调的特性，建立一种通过检测多环芳烃类物质对上述启动子的激活情况，实现对环境中多环芳烃类物质检测的方法。
[0009]本发明通过提取人AHR基因启动子，以含有萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶报告基因的CV060质粒为载体，插入AHR基因启动子，构建一种含有AHR基因启动子和双荧光素酶报告基因的重组慢病毒质粒。
[0010]所述的人源性AHR基因的启动子序列见SEQIDN0:1。
[0011]所述的AHR基因的启动子，获取该启动子使用的引物序列为:AHR-pix)m0ter-Pl:
[0012]TGGTTAATTAAGGCACTACACTATACTGTATTC, SEQIDN0:2 ；AHR-promoter-P2:
[0013]CGGGCTAGCAACAGAGCGTCGACGGGACTC, SEQIDNO:3。
[0014]所述的重组慢病毒质粒，其特征是含萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶报告基因，兀件顺序为 MCS-f iref ly_Luc-Tk-ReniIla_Luc。
[0015]所述的重组质粒中的AHR基因启动子序列长度为2111bp。
[0016]本发明所述的含AHR基因启动子和双报告基因的重组质粒，其中的载体质粒和AHR基因启动子都含有PacI/和NheI双酶切位点。
[0017]本发明通过以下方法和步骤构建所述的含有人源性AHR基因启动子和报告基因的重组质粒:
[0018]1.制备含有AHR基因启动子基因组DNA
[0019](1)提取含有AHR基因启动子的基因组DNA ；
[0020](2)扩增、纯化AHR基因启动子目的片段；
[0021]2.大量制备慢病毒表达载体CV060
[0022]3.构建稳定表达AHR基因启动子的重组质粒
[0023](I)含有AHR基因启动子目的片段和CV060载体质粒的双酶切；
[0024](2)酶切后的AHR基因启动子目的片段和CV060载体质粒的酶连；
[0025](3)筛选连接后的重组质粒并大量扩增制备。
[0026]本发明的另一个目的是提供一种含上述重组慢病毒质粒的用途，所述的重组慢病毒质粒主要用于环境中多环芳烃类物质的检测。为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案:
[0027]将上述的重组慢病毒质粒，经慢病毒包装后，转染人293T细胞，多环芳烃类物质刺激转染后的人293T细胞，可以诱导AHR启动子的调控序列表达调控作用的蛋白，诱导表达荧光素酶，加入荧光素酶底物后，能够产生化学发光，检测双荧光素酶报告基因的活性，通过萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性比值来反映环境中多环芳烃类物质的存在，且比值大小严格受到诱导物含量的控制。[0028]本发明通过以下步骤实现含有AHR基因启动子的重组慢病毒质粒在环境中多环芳烃类物质的检测用途:
[0029]1.含AHR基因启动子的重组质粒的慢病毒包装
[0030](I)将该重组质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，共转染人293T细胞，收集转染后的细胞上清液，并进行浓缩；
[0031](2)测定病毒滴度；
[0032]2.目的细胞的转染
[0033](I)将人293T细胞按一定的比例接种到细胞培养板中，培养过夜；
[0034](2)将制备的病毒液稀释至合适的滴度，转染人293T细胞；
[0035](3)转染8-12小时后，换新鲜的完全培养基，继续培养3-4天；
[0036]3.分别加入待测样品、不同浓度的多环芳烃标准品处理转染后的细胞
[0037]4.检测转染后的细胞的双荧光素酶报告基因活性
[0038](I)裂解经待检测样本、标准品处理24小时的293T细胞；
[0039](2)利用双报告基因检测试剂盒，检测双报告基因的活性；
[0040](3)根据双荧光素酶报告基因活性的比值大小，对照标准曲线可计算出待测样本中多环芳烃类物质的含量。
[0041]本发明构建的重组慢病毒质粒具有以下优点:
[0042](I)双荧光素酶报告基因法具有灵敏度高、检测速度快、费用低的特点，且能克服转染效率对结果的影响；
[0043](2)萤火虫荧光素酶(报告基因)和海肾萤光素酶基因(内参基因)被置于同一载体上，各自含有独立的启动子，活性稳定，线性范围广，可以满足检测多环芳烃类物质的需要；
[0044](3)慢病毒载体具有感染谱广、效率高、免疫原性较低等特点，感染宿主细胞后可长期、稳定地表达外源基因；
[0045](4)可应用于所有多环芳烃类物质的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0046]图1.质粒表达检测数据分析图，结论:从定量PCR结果可以看出，293T细胞中，OE组Luciferase表达丰度是NC组的82478倍(Ρ〈0.05)。
[0047]图2.建立检测苯并芘的双报告基因活性比值的标准检测曲线。
【具体实施方式】
[0048]本发明利用PCR方法，从人外周血白细胞中扩增出AHR基因的启动子序列，将目的载体进行酶切，酶切产物电泳回收后进行交换，将其产物转化细菌感受态细胞，对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的即为构建成功的目的质粒。将该重组慢病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，分别进行高纯度无内毒素抽提，按Inv itrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染人293T细胞，转染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度。培养生长状态良好的人293T细胞,质粒转染前一天将细胞接种到96孔板中，实验当天按照最佳感染条件进行慢病毒转染，转染8-12小时后，观察细胞的状态，并更换为新鲜的培养基，继续培养3-4天，多环芳烃物质刺激转染后的293T细胞，培养24小时后裂解细胞，利用双报告基因检测试剂盒，测定双报告基因的活性，根据双荧光素酶报告基因活性的比值大小，对照标准曲线可计算出特异性物质的含量。
[0049]下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
[0050]实施例1
[0051]1.过表达慢病毒质粒的制备
[0052]含有AHR基因启动子基因组DNA (NM_001621-promoter)提取自正常人外周血白细胞，采用基因组DNA纯化试剂盒(天根生化，DP318)的操作方法提取人基因组DNA。根据已知人的AHR基因启动子序列设计并合成两端引物:上游引物:TGGTTAATTAAGGCACTACACTATACTGTATTC 见 SEQIDN0:2 ;下游引物:CGGGCTAGCAACAGAGCGTCGACGGGACTC，见 SEQIDN0:3。以基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化，DP209-03)回收纯化。
[0053]慢病毒表达载体CV060 (兀件的顺序为 MCS-firefly-Luc-Tk-Renilla-Luc),购自上海吉凯基因化学技术有限公司，通过PacI和NheI限制性内切酶(Takara公司)，于 37°C孵育 2h 酶切回收 firefly_Luc-Tk-Renilla_Luc 基因片段。利用 In-Fusion?PCRCloningKit (clontech公司，Cat.N0.639626)将AHR基因启动子目的片段连接入线性化的慢病毒表达载体。将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，长出的阳性克隆进行后续的PCR鉴定，与预期结果符 合，对其进行测序分析表明，测序结果采用NCBIBLAST比对，结果100%匹配，没有发生移码改变，表明克隆的目的基因序列正确，AHR过表达的慢病毒质粒构建成功。
[0054]2.慢病毒包装与滴度检测
[0055]人293T细胞用含10%血清的DMEM培养基培养。定量PCR检测重组质粒的表达丰度。转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。向一灭菌离心管中加入所制备各DNA溶液(pGC-LV 载体 20 μ g, pHelperl.0 载体 15 μ g, pHelper2.0 载体 10 μ g),与相应体积的Opt1-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml,在室温下温育5min。将Lipofectamine2000(Invitrogen 公司，Cat.N0.11668-500)试剂轻柔摇匀，取 100 μ lLipofectamine2000试剂在另一管中与2.4ml0pt1-MEM混合，在室温下温育5min。把稀释后的DNA和Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，在室温下温育20min。将DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物转移至293T细胞培养液中，混匀，于37°C，5%C02细胞培养箱中培养。培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，加入新鲜的完全培养基继续培养48h。收集转染48h的293T细胞上清液，进行浓缩，得到浓缩的病毒液。
[0056]本发明采用Realtime定量PCR法测定病毒的滴度。样品准备:检测前一天，对293T细胞传代，每个24孔中加I X IO5个细胞，体积为500 μ I ;次日，准备7~10个无菌EP管，在每个管中加入90 μ I的培养基(DMEM+10%FBS);将待测定的病毒原液10 μ I加入到第一个管中，混匀后，取10μ I加入到第二个管中，继续相同的操作直到最后一管。选取所需的细胞孔，吸去90 μ I培养基。加入稀释好的病毒溶液继续培养24h后，加入新鲜培养基500 μ L.4天后，抽提RNA准备做RT-qPCR。总RNA抽提根据Invitrogen公司的TRIZOL操作说明书进行，均为RNase-free操作。将获得的RNA，根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行逆转录获cDNA，均为RNase-free操作。M-MLV逆转录酶和dNTP购自Promega公司，OligodT 购自上海生工，RNase-free 物品都购自 Axygen。Real-timePCR 在 Takara 的TP800上完成，SYBRMasterMixture来自Takara。通过比较对照组和试验组的Ct值差异判断滴度值。从RealtimePCR结果(图1)可以看出，293T细胞中，OE组(为目的基因质粒转染293T后样品)Luciferase表达丰度是NC (为293T细胞样品，即对照组)组的82478倍(P〈0.05)。本次滴度检测中，在ΙΟΛιΙ组中检测到目的基因表达，故认为在ΙΟΛιΙ组样品中存在病毒颗粒。假定该组样品含有至少I个病毒颗粒，则病毒的滴度为:1/(1.00Ε-04)*20=2.00E+5TU/ul=2.00E+8TU/ml。
[0057]试验数据如下:
【权利要求】
1.一种质粒，其特征在于用人源性AHR基因启动子连接内参内置型双荧光素酶报告基因的慢病毒载体，构建AHR过表达的重组慢病毒质粒。
2.根据权利要求1所述的一种质粒，其特征在于所述的人源性AHR基因的启动子序列见 SEQ ID NO:1。
3.根据权利要求2所述的一种质粒，其特征在于所述的AHR基因的启动子，获取该启动子使用的引物序列为:TGGTTAATTAAGGCACTACACTATACTGTATTC，见 SEQ ID NO:2 ；CGGGCTAGCAACAGAGCGTCGACGGGACTC，见 SEQ ID NO: 3。
4.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于所使用的内参内置型双荧光素酶报告基因的慢病毒载体为CV060，元件的顺序为MCS-firefly-Luc-Tk-ReniIIa-Luc，包含PacI/和NheI双酶切位点。
5.利用权利要求1所述的质粒检测环境中多环芳烃化学物的方法，其特征在于利用所述的重组质粒经慢病毒包装后，转染人293T细胞株，感染复数MOI为2，转染8 - 12小时，换新鲜的完全培养基，继续培养3 - 4天，利用多环芳烃类物质刺激转染后的293T细胞，通过检测双荧光素酶报告基因活性的比值来检测样本中多环芳烃类物质的存在。
6.根据权利要求5所述的检测环境中多环芳烃化学物的方法，其特征在于检测时间是在多环芳烃类物质刺激转染后的人293T细胞之后的24小时。
7.根据权利要求5所述的检测环境中多环芳烃化学物的方法，其特征在于:在多环芳烃诱导物刺激转染后的人293T细胞后，检测双荧光素酶报告基因的活性，根据双荧光素酶报告基因活性的比值大小 ，对照标准曲线可计算其含量。
【文档编号】C12Q1/68GK103898162SQ201410105958
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】顾爱华, 严丽锋, 吉贵祥, 赵鹏 申请人:南京医科大学