一株菲高效降解菌株Sphingobium sp．Phe-1及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于有机污染物降解菌技术领域。更具体地，涉及一株菲高效降解菌株Sphingobium sp.Phe_l 及其应用。
【背景技术】
[0002]多环芳烃类化合物(PAHs)是环境中普遍存在的持久性有毒有机污染物。大量研究证实，多环芳烃具有慢性毒性和致癌、致畸、致突变的“三致”作用，引起各国环境科学工作者的广泛关注。菲(分子式C14H10)作为一种广泛分布于自然环境的三环芳烃，含有多环芳经中与“三致”关系密切的化学结构一K-reg1n和Bay-reg1n，因此成为多环芳经污染研究的模式化合物。对菲生物降解的研究，不仅有助于环境中菲污染的消除，还可帮助人们了解其它多环芳烃的降解机制及生物降解的可行性，为多环芳烃及石油污染环境的生物修复提供相应的理论依据和治理措施。
[0003]微生物降解是一种环保稳定持续的治理方法，目前已发现的菲的降解菌有气单胞菌属 Aeroinones sp.，假单胞菌属 Pseuckmonss sp.，黄杆菌属 Flavobacterium sp.，鞘氨醇菌属印.等(Juhasz and Naidu, 2000)。如:一株鞘氨醇单胞菌Sphingosine sp.GY2B对10mg/L和60 mg/L初始浓度的菲，分别需要24和60 h降解完全(陶雪琴et al., 2007);另一株鞘氨醇单胞菌Sphingosine印.//在48 h内对50 mg/L菲的降解率为98% (雷欢，2008);还有其他菌属如戈登氏菌sp.)，分枝杆菌{Mycobacterium sp.)，固氮螺菌(如sp.)，在10d内对初始质量浓度为50 mg/L的菲的去除率为27.16 %?55.13 % (杨秀虹等，2009)。
[0004]但是，这些微生物菌株对菲的降解效率，包括降解程度和降解时间还十分不足。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有菲等多环芳烃降解技术的缺陷和不足，目的是提供一株菲高效降解菌株sp.Phe-1及其应用。
[0006]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一株菲高效降解菌株Sphingobium sp.Phe_l，于2015年8月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.11239，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0007]该菌株的单菌落呈黄色，菌落呈规则圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，在显微镜下细胞呈杆状，革兰氏染色呈阳性，易着色。
[0008]—种菲高效降解剂，以上述菲高效降解菌株sp.Phe_l或其菌悬液为主要活性成分。
[0009]上述菲高效降解菌株5/Λ Phe_l，或上述菲高效降解剂，在降解多环芳烃类化合物(PAHs )方面的应用也在本发明的保护范围之内。
[0010]优选地，所述多环芳烃类化合物为菲。具体是指含有菲的溶液中的菲。
[0011]更具体地，所述含有菲的溶液是指为菲污染液或菲污染土壤的水溶液。即本发明的降解菌株Phe-Ι可以实现任何被菲污染的介质的处理净化。
[0012]更进一步优选地，所述菲在溶液中的浓度为200mg/L以下。即降解菌株Phe_l可很高效的实现对200mg/L浓度以下的菲的降解。
[0013]具体优选地地，上述应用的条件为在pH 5?8、20?35°C条件下实现对菲的降解。
[0014]更优选地，上述应用的条件为在pH 6?7、30?35°C条件下实现对菲的降解。
[0015]最优选地，上述应用的条件为在pH 7、35°C条件下实现对菲的降解。
[0016]作为一种优选的可实施方案，上述应用的具体方法为:按照1?5%的体积比，将降修.Sphingobium sp.Phe-1的菌悬液接种至含有菲的污染液体中。
[0017]优选地，所述菌悬液中降解菌株sp.Phe-1的细胞个数为109/mL。
[0018]优选地，菌悬液的接种体积比为1%。
[0019]本发明从清远某炼油厂土壤中，通过富集培养和分离纯化的方式筛选出一株菲的高效降解菌，革兰氏染色呈阳性，经16S rRNA鉴定，该菌株隶属于鞘脂菌属(Sphingobium)，命名为Sphingobium sp.Phe_l，该菌株已于2015年8月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.11239，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0020]该菌株在温度为30°C的恒温培养箱中培养48h，能看到清晰的单菌落，开始时是淡黄色，慢慢变成黄色；菌落呈规则圆形，边缘整齐，表面光滑湿润。在显微镜下细胞呈杆状，革兰氏染色呈阳性，容易着色。
[0021]本发明的降解菌株Phe-Ι在35°C、pH 7.0、菲浓度为100 mg/L的条件下，能获得较好的生长以及非常高的菲的降解率，在48 h能把100 mg/L的菲降解完全，说明降解菌株Phe-Ι是一株菲的高效降解菌株，适合用作污染场地修复菌株，对比其他降解菌具有很好的降解优势。
[0022]本发明具有以下有益效果:
本发明首次筛选到了一株能够高校降解菲的菌株Sphingobium sp.Phe-1，该菌株对菲具有非常好的降解效果，在48 h能把100 mg/L的菲降解完全(降解率达100%)，是一株菲的高效降解菌株，适合用作污染场地修复菌株，对比其他降解菌具有很好的降解优势。
[0023]同时，本发明的降解菌Phe-Ι在对菲的降解应用时，条件相对比较宽松，可在pH5?8、20?35°C条件下实现对200mg/L浓度以下的菲的降解，甚至可降解更高浓度的菲，应用范围更广。
【附图说明】
[0024]图1为降解菌株Sphingobium sp.Phe-1的菌落形态。
[0025]图2为降解菌株Sphingobium sp.Phe-1的显微镜观察。
[0026]图3 为降解菌株 Sphingobium sp.Phe-1 的 16S rRNA 电泳图谱。
[0027]图4为降解菌株Sphingobium sp.Phe-1的系统发育树。
[0028]图5为温度对降解菌株Phe-Ι生长量的影响。
[0029]图6为pH对降解菌株Phe-Ι生长量的影响。
[0030]图7为菲浓度对降解菌株Phe-Ι生长量的影响。
[0031]图8为不同培养时间下菲浓度对降解菌株Phe-1生长量的影响。
[0032]图9为降解菌株Phe-Ι的生长曲线。
图10为降解菌株Phe-Ι对菲的降解曲线。
【具体实施方式】
[0033]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0034]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0035]以下实施例所用试剂如下:
(1)无机盐液体培养基:将无机盐溶液中加入微量元素溶液1 mL/L，用高纯水定容至1000 mL，调节 pH 7.0，121°C 灭菌 30 min，备用。
[0036]其中，无机盐溶液包括:(NH4)2S04 (分析纯)3 g/L，ΚΗ2Ρ04 (分析纯)0.5 g/L，Na2HP04(分析纯)0.5 g/L, MgS04 (分析纯)0.2609 g/L ；
微量元素溶液包括:FeCl3 (分析纯)0.3 g/L, FeS04 7H20 (分析纯)0.3 g/L, MnS04H20(分析纯)0.15 g/L, ZnS04 (分析纯)0.14 g/L, C0C12 (分析纯)0.2 g/L。
[0037](2)无机盐固体培养基:无机盐液体培养基中加入琼脂20 g/L，高压灭菌后取出倒置平板，凝结后备用。
[0038](3) LB液体培养基:蛋白胨(分析纯)10 g/L，酵母浸膏(分析纯)5 g/L, NaCl (分析纯)10 g/L。
[0039](4)LB固体培养基:LB液体培养基中加入琼脂20 g/L,高压灭菌后取出倒置平板，凝结后备用。
[0040](5)筛选培养基:向无机盐液体培养基中加入菲，使其终浓度达到10、50、100、150、250 mg/Lο
[0041]菲标准液配制:称取0.4 g菲固体溶解于丙酮中，定容至50 mL,制成浓度为4000mg/L的菲标准液。
[0042]上述所用琼脂(分析纯)20 g/L, NaOH (分析纯)40 g/L, H2S04 (分析纯)161 g/L,菲(>98%) 4 g/L。
[0043]实施例1菲高效降解菌株的筛选
1、土壤样品
土壤样品采自清远市清城区龙塘镇炼油厂(北玮N23° 36' 20.86 " 东经E113。04r 19.34) 土，去除杂物，装于封口袋中，于4°C冰箱保存。
[0044]土壤悬液制备:称取10g 土壤于90mL高纯水中，在30°C，180 rpm振荡30min。
[0045]2、高效降解菌株筛选 (1)富集培养
取菲标准液0.5 mL于干燥的灭菌的三角瓶中，待丙酮挥发完全，量取90 mL无机盐液体培养基于三角瓶中，再量取土壤悬液10 mL于三角瓶中，使菲浓度为10 mg/L，于25°C、160 rpm培养箱中避光培养5d。依次提高菲浓度为50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、250 mg/L，转接液为10mL，培养周期为5d。
[0046](2)分离纯化
取最后一次富集培养菌液稀释到10 2、10 4、10 6 mg/L,取0.lmL涂布到LB固体培养基上(菲浓度为50 mg/L，采用二氯甲烷喷涂，待二氯甲烷挥发完全后再接种菌液)，三个平行，将平板置于30°C培养箱中，观察菌落生长情况。
[0047]将平板上生长较大的单菌落挑出，接种到无机盐液体培养基(菲浓度为50 mg/L)中培养2d，将培养菌液稀释到10 2、10 4、10 6 mg/L,取0.1 mL涂布到LB固体培养基上(菲浓度为50 mg/L，采用二氯甲烷喷涂，待二氯甲烷挥发完全后再接种菌液)，三个平行，将平板置于30°C培养箱中，重复直到菌种纯化。
[0048]将纯化后的菌种保存在喷涂菲的无机盐斜面上，待长出较大菌落后置于4°C冰箱保藏备用。
[0049](3)菌悬液制备
将纯化后的菌种接种到含有菲的无机盐液体培养基中，于30 °C，160 rpm培养箱中避光培养2d，4000 r/min离心20 min,弃上清液加入磷酸盐缓冲液振荡均匀后再次离心，重复2?3次，将细胞浓度调整到109个/mL备用。
[0050](4)菌种保存
斜面保存:接种于LB斜面上，30°C培养1?2天，保存于4 °C冰箱，1?2月后转接(转接至新配的斜面培养基上，培养1?2d后按上法保存)。
[0051]甘油保存:15%灭菌的甘油+85%的菌液，振荡，使之混合均匀，置于