猪细环病毒ii型检测的引物、探针及实时荧光pcr检测方法
【专利摘要】本申请公开了一种用于猪细环病毒II型检测的引物、探针及其实时荧光PCR检测方法。本申请为猪细环病毒II型的检测提供了一种全新的检测引物，具有很强的特异性和灵敏度，能够满足猪细环病毒II型的日常检验检疫需求；为猪细环病毒II型的检疫、流行病学调查，以及为生产中指导猪细环病毒II型的检测提供了技术帮助。
【专利说明】猪细环病毒I I型检测的引物、探针及实时荧光PCR检测方法
【技术领域】
[0001]本申请涉及分子检测领域，特别是涉及一种用于猪细环病毒II型检测的引物、探针及实时荧光PCR检测方法。
【背景技术】
[0002]TTV是一种无包被的单股环状负义的DNA病毒，由于最初是在肝炎患者中分离得到，猜测与肝炎有关，受到医学领域的广泛关注。猪源TTV的中文名字被定义为猪细环病毒(Torque Teno Sus Virus, TTSuV)0流行病学研究发现,TTV通过输血、性行为、粪-口途径等方式进行传播，同时血液、唾液、粪便、乳汁、胆汁均可带毒,通过不同人群的TTV的感染率的研究结果显示:一般人群的感染率多在10%以....t,呈无症状携带。除了人可感染TTV以外，猫、狗、猪、牛、鸡、羊、老鼠等动物也是TTV的宿主。Okamota H等根据人TTV非编码区的DNA序列设计引物,扩增了猪、狗和猫血清中的TTV基因片段,发现在这几个不同种属中TTV基因序列和长度差异极大,核酸同源性较小,具有物种专一注。美国学者Leary等应用巢式PCR方法从猪血清中检测到TTV (Sd-TTV31)，基因组长度为2878bp。2005年，Niel C等利用多重引导滚环式扩增法(Multiply primed rolling-circle amplification, RCA)检测到猪TTV的另一种亚型:Sd-TTV2p,基因组长度为2735bp,与之前发现的Sd-TTV31的同源性非常低,只有45.1%,于是将TTSuV分为两种基因型，TTSuVl型以Sd_TTV31为原型，TTSuV2型以Sd-TTV2p为原型。目前，统一的将TTSuVl型称为猪细环病毒I型(简写TTSuVI), TTSuV2型称为猪细环病毒II型(简写TTSuV II)。
[0003]TTSuV和人TTV基因组结构组成相似，由非编区(UTR)和编码区两部分组成，非编区由一个富含GC的区域、一个启动子和一个转录增强子组成,两末端的GC区域形成具茎环的二级结构，在病毒复制中可能有重要调控作用JTV编码区包含3个开放阅读框(0RR~0RF3)、一个PolyA和一个TATA盒，变异率较高。ORFl的N端富含精氨酸(Arg)蛋白质，该蛋白旗有可能是复制相关的蛋白-Rep蛋白；()RF2编码与复制相关的蛋白；0RF3编码结合蛋白，分为两段,其中隔着一个类似于真核生物编码区中内含子的序列。编码区转录时产生3种不同的mRNA，能翻译表达6种不同的蛋白。两种基因型TTV编码蛋白具有相似的序列和功能。
[0004] 国外已有许多相关报道，表明TTSuV的感染在全球分布很广且其流行率很高。Segales等对西班牙猪场1985-2005年采集的162份猪血清进行追溯性调查,结果在所有年份均检出TTSuV病毒,TTSuVl和TTSuV2的感染率分别是33.3%(54/162)和55.6%(90/162),两种基因型共感染率为23.5% (38/162)，证实了 TTSuV的感染早在最初发现这病毒(Learyet al., 1999)的14年前就存在了。
[0005]近年来，国内也陆续开展了对TTSuV感染情况的研究。这些研究显示,TTSuV在猪群中的感染在国内外已经非常普遍,是一个不容忽视的新病原。而目前对TTSuV的了解还非常有限，综合国内外检测TTSuV的方法主要有血清免疫学法和分子生物学法，血清免疫学法有酶联免疫吸附(ELISA)法，ELISA是用于疫病检测和监控的常用方法,但由于TTSuV具有高度基因变异性，不同基因亚型抗体间存在交叉反应，用它对基因变异进行分析时准确率较低，不能完全反映体内基因变异情况，更重要的是ELISA法的漏检率较高。除此之外，由于感染时间较短而尚未产生抗体也可造成ELISA实验结果的假阴性。
[0006]目前用于TTSuV检测的分子生物学方法主要有普通PCR、套式PCR、半套式PCR和滚环扩增等方法。常规PCR和套式PCR方法均根据目前已知的TTSuV基因序列的最保守的非编码区来设计引物，对核酸进行检测。滚环扩增法是以任意的寡核苷酸作为引物，在恒温下以滚环扩增待测环状DNA。由于血清中TTSuV病毒滴度较低,用普通PCR —轮难以扩增出目的片段,需加大循环数，但这样会使引物非特异性结合或者聚合酶活性下降。巢氏PCR克服了单次扩增“平台期效应”的限制且保证了反应的特异性，但是需要进行第二次PCR，引起交叉污染的几率较大。普通PCR敏感性较差,巢氏PCR、半巢氏PCR和滚环扩增耗时较长，且这些传统的PCR技术只能对基因的检测做定性分析,无法精确的定量所检测出的基因数量,大大制约了 PCR技术的应用。
[0007]Taqman荧光定量PCR是近年来发展起来的一项核酸检测技术,可以快速、敏感地检测出核酸中的目的基因。采用引物和探针相结合，对基因片段进行扩增,其特异性更强，检测更准确。利用荧光信号与PCR产物的对应关系来对检测样本进行定性及定量分析，敏感性极高,可以检测到几个拷贝/μ L的病毒核酸。在检测过程中荧光定量PCR方法无需进行凝胶电泳，用仪器收集荧光进行判断结果，避免了人为主观因素的影响。而且与常规PCR技术相比，其检测速度更具有优势,可以在4-6h内完成。而目前针对用于检测TTSuV的高通量、快速、灵敏的Taqman突光定量PCR检测方法的研究较少；远不能满足检验检疫实践应用的需求。
【发明内容】
[0008]本申请的目的是提供一种全新的用于猪细环病毒II型检测的引物、探针以及基于该引物和探针的实时荧光PCR检测方法。
[0009]为了实现以上目的，本申请的一方面公开了一种用于猪细环病毒II型检测的引物，该引物包括上游引物和下游引物,其中，上游引物含有Seq ID N0.4所示序列，下游引物含有Seq ID N0.5所示序列；
[0010]Seq ID N0.4:5，-TATCGGGCAGGCGGTAATC-3’
[0011]Seq ID N0.5:5，-TACGCTACCGTCAGCCATCTTT-3’。
[0012]本申请的另一面公开了一种用于猪细环病毒II型检测的探针，该探针含有Seq IDN0.6所示序列；
[0013]Seq ID N0.6:5，-AACCGGGCCCCCCTCGATG-3，。
[0014]优选的,探针的5 ’端标记有焚光报告基团，3 ’端标记有焚光淬灭基团。
[0015]更优选的，探针的荧光报告基团为ffiX，荧光淬灭基团为BHQ1。
[0016]本申请的另一面公开了一种猪细环病毒II型的实时荧光PCR检测方法,包括采用本申请的引物和探针进行Taqman荧光定量PCR检测。
[0017]本申请的再一面公开了一种猪细环病毒II型的检测试剂盒，该检测试剂盒中含有本申请设计的引物。[0018]进-一步的,本申请的检测试剂盒中还含有本申请设计的探针。
[0019]本申请的再一面公开了本申请的检测试剂盒在猪细环病毒II型检测中的应用。
[0020]本申请的再一面公开了一种采用本申请的检测试剂盒对猪细环病毒II型进行的检测，该检测包括但不限于,常规PCR、染料法实时荧光PCR、探针法实时荧光PCR中的至少
-一种O
[0021]由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于:
[0022]本申请为猪细环病毒II型的检测提供了一种全新的检测引物,具有很强的特异性和灵敏度，能够满足猪细环病毒II型的日常检验检疫需求；为猪细环病毒II型的检疫、流行病学调查，以及为生产中指导猪细环病毒II型的检测提供了技术帮助。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1:是本申请实施例中巢式PCR电泳结果图,其中A为样品扩增结果，B为克隆后的菌落PCR电泳结果；
[0024]图2:是本申请实施例中提取质粒的酶切结果图；
[0025]图3:是本申请实施例中TTSuVl标准品(10 O退火温度优化结果；
[0026]图4:是本申请实施例中TTSuVl标准品10-1-10-6退火温度优化结果；
[0027]图5:是本申请实施例中TTSuVl标准品(KT1-1CT6)优化的标准曲线；
[0028]图6:是本申请实施例中TTSuV2标准品(10’退火温度优化结果；
[0029]图7:是本申请实施例中TTSuV2标准品(IO1-1O 6)退火温度优化结果；
[0030]图8:是本申请实施例中TTSuV2标准品(I0-1-1CT6)优化的标准曲线；
[0031 ]图9:是本申请实施例中TTSuVl实时荧光PCR的特异性试验结果；
[0032]图10:是本申请实施例中TTSuV2实时荧光PCR的特异性试验结果；
[0033]图11:是本申请实施例中TTSuVl实时荧光PCR的灵敏度测试结果；
[0034]图12:是本申请实施例中TTSuV2实时荧光PCR的灵敏度测试结果；
[0035]图13:是本申请实施例中TTSuVI标准品的扩增曲线；
[0036]图14:是本申请实施例中TTSuVl标准品的标准曲线；
[0037]图15:是本申请实施例中TTSuV2标准品的扩增曲线；
[0038]图1.6:是本申请实施例中TTSuV2标准品的标准曲线；
[0039]图17:是本申请实施例中双重实时荧光PCR的特异性结果；
[0040]图18:是本申请实施例中双重实时荧光PCR对TTSuVl的灵敏度检测；
[0041]图19:是本申请实施例中双重实时荧光PCR对TTSuV2的灵敏度检测。
【具体实施方式】
[0042]本申请以TTSuV不同基因型的保守序列为目的片段进行研究，设计实时荧光定量PCR的引物及Taqman探针，最终获得分别针对TTSuVl和TTSuV2的非编码区(UTR)设计的特异性引物和Taqman探针，分别建立检测TTSuVl和TTSuV2的单重实时荧光PCR检测方法。另外,考虑到临床检测的工作量和检验检疫业务快速准确的要求，本申请在建立的单重实时荧光PCR方法的基础上，建立了同时检测TTSuVl和TTSuV2双重实时荧光PCR方法。
[0043]本申请在现有研究的基础上进一步研究,从而犹得了一对全新的检测引物和探针，为猪细环病毒I型和猪细环病毒II型的检测提供了一种新的方案,从而提高了检验检疫的质量和工作效率，对检验检疫和实践生产都具有重要的意义。需要说明的是，本申请的引物和探针都是针对实时荧光PCR检测而设计的，具体的是特别针对双重实时荧光PCR方法而设计的；因此，本申请的引物和探针都具有很好的特异性；可以理解，在本申请的基础上，完全可以单独将本申请的引物直接用于常规PCR检测或者其它基于PCR扩增的检测；同样的，本申请的探针也完全可以用于除了本申请的实时荧光PCR方法的其它检测中，比如基因芯片检测，或者其它基于核苷酸片段的检测。其中，基于PCR扩增的检测如基因芯片的靶标片段扩增、克隆、测序等。
[0044]还需要说明的是,将本申请的探针用于实时荧光PCR检测时,根据探针法实时荧光PCR检测的原理，探针的5 ’端需要标记荧光报告基团，3 ’端需要标记荧光淬灭基团,可以理解，如果不考虑双重或多重实时荧光PCR检测,现有的荧光报告基团和荧光淬灭基团都可以用于本申请。另外，本申请的实时荧光PCR检测方法中，其关键在于采用了本申请设计的引物和探针，可以理解，检测样品可以是培养提纯的病毒样品、提取自疑似感染的生物的组织或分泌物的样品或通过其它方式提取或保存的样品。
[0045]在本申请的引物、探针和实时突光PCR检测方法的基础上，本申请进一步研究了用于检测猪细环病毒II型的检测试剂盒。可以理解，直接将本申请的引物或探针制备成干粉或者高浓度的溶液即可作为试剂盒组分保存备用。另外,如前面所提到的,本申请的引物或者探针可以单独的用于其它的检测使用，因此，试剂盒中同样可以只含有引物或探针；此外，对于涉及到的常规PCR检测或实时荧光PCR检测等所需要的试剂,可以直接放置于本申请的试剂盒中，也可以在使用试剂盒时，从市场购买相应的试剂,在本申请中不做具体限定。
[0046]本申请中的检测试剂盒在猪细环病毒II型检测中的应用，如前面所述，同样的，该应用也包括了目前的各种基于引物和/或探针的核酸分子检测；如常规PCR、实时荧光PCR、基因芯片、克隆、测序等等ο
[0047]还需要说明的是,本申请中的染料法实时荧光PCR和探针法实时荧光PCR是实时荧光PCR方法中的两大类型；染料法实时荧光PCR如SYBR GREEN等，是利用染料与双链DNA结合后荧光强度大大增强实现检测的，因此可以仅用一对特异性的引物即可进行；探针法实时荧光PCR如Taqman实时荧光PCR,是利用特异性探针两端标记的荧光报告基团和荧光淬灭基团,在探针完整时报告基团的信号被淬灭基团吸收,而PCR扩增时将结合到模板上的特异性探针被酶切降解，报告基团和淬灭基团分开，产生可以被检测的荧光信号，实现实时荧光PCR检测。
[0048]下面通过具体实施例并结合附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本申请进行进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。
[0049]一、试验材料和设备
[0050]1.工具酶和主要试剂
[0051]MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit 购自 Roche。Premix ExTaqTM(Perfect Real Time) ,Premix Ex Taq、Ex Taq、dNTP Mixt'ure、2XGC buffer 1、DNAMarker DL2000、DNA Marker DL5000、凝胶 DNA 回收试剂盒、pMD18_T Vector、质粒 DNA 小量纯化试剂盒等购于大连宝生物公司。Jml09大肠杆菌、IPTG、X-Gal、甘油、NaCl均为分析纯，购自上海生工。Ampicillin、CaC12购自Sigma。琼脂糖购自Promega。胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉等购自广东环凯微生物科技公司。胶红购自Biotium。
[0052]2.试验仪器
[0053]本实验中使用的主要仪器如表1所示。
[0054]表1实验中使用的主要仪器
[0055]
【权利要求】
1.一种用于猪细环病毒I1:型检测的引物,其特征在于:所述引物包括上游引物和下游引物,所述上游引物含有Seq ID N0.4所示序列,所述下游引物含有Seq ID N0.5所示序列;
Seq ID N0.4:5’ -TATCGGGCAGGCGGTAATC-3’
Seq ID N0.5:5’ -TACGCTACCGTCAGCCATCTTT-3’。
2.一种用于猪细环病毒II型检测的探针,其特征在于:所述探针含有Seq ID N0.6所-小'序列;
Seq ID N0.6:5’ -AACCGGGCCCCCCTCGATG-3’。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于:所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于:所述荧光报告基团为HEX，所述荧光淬灭基团为BHQl。
5.一种猪细环病毒I1:型的实时荧光PCR检测方法，包括采用权利要求1所述的引物和权利要求3或4所述的探针进行Taqman荧光定量PCR检测。
6.一种猪细环病毒II型的检测试剂盒，其特征在于:所述检测试剂盒中含有权利要求1所述的引物。
7.根据权利要求6所 述的检测试剂盒，其特征在于:所述检测试剂盒中还含有权利要求2-4任一项所述的探针。
8.根据权利要求6或7所述的检测试剂盒在猪细环病毒II型检测中的应用。
9.一种采用权利 要求6或7所述的检测试剂盒对猪细环病毒II型进行的检测，所述检测包括但不限于,常规PCR、染料法实时荧光PCR、探针法实时荧光PCR中的至少一种。
【文档编号】C12N15/11GK103882150SQ201410105922
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】杨春华, 孙思扬, 马欣欣, 祝建新 申请人:江西出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心