一种利用基因芯片检测跌打镇痛膏药效的方法
【专利摘要】一种利用基因芯片检测跌打镇痛膏药效的方法，依次包括如下步骤：A：取一家兔，然后采用重锤坠落法制备软组织损伤模型；步骤B：在A步骤完成的24小时后，测量家兔软组织损伤评分；步骤C：在家兔的损伤部位贴上跌打镇痛膏；步骤D：在家兔的取损伤部位处提取RNA，备用；步骤E：选用DNA芯片，与步骤D提取的RNA进行原位杂交；步骤F：采用基因芯片扫描仪进行扫描、获取扫描信号和数据，最后将信号和数据利用Quantile算法进行归一化处理。本发明的检测方法，操作方便、准确性和稳定性良好，能够很好的检测跌打镇痛膏的药效和作用机制。
【专利说明】一种利用基因芯片检测跌打镇痛膏药效的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种跌打镇痛膏的药效检测方法，尤其是涉及一种利用基因芯片检测跌打镇痛膏药效的方法。
【背景技术】
[0002]目前，我国跌打镇痛膏类产品的药物作用及作用机制的研究几乎处于起步阶段，文献以临床疗效观察为主，如自制活血化瘀膏的疗效观察，跌打伤痛膏治疗急性闭合性软组织损伤的临床观察等。701跌打镇痛膏亦未进行深入的机制研究。目前，报道的文献仅I篇，即关于701跌打镇痛膏的营销策略研究，未涉及作用及机制研究。
【发明内容】
[0003]本发明提供了一种利用基因芯片检测跌打镇痛膏药效的方法，能够很好的揭示跌打镇痛膏的作用机制和原理 。
[0004]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下:
[0005]一种利用基因芯片检测跌打镇痛膏药效的方法，依次包括如下步骤:
[0006]A:取一家兔，然后采用重锤坠落法制备软组织损伤模型:选用重量为Ikg的重锤，从家兔后退根部软组织的垂直上方20cm处自由落下，获得软组织损伤模型；步骤B:在A步骤完成的24小时后，测量家兔软组织损伤评分，其中测定痛阀采用的仪器为压痛仪，红肿范围不小于I平方厘米；步骤C:在家兔的损伤部位贴上跌打镇痛膏；步骤D:在家兔的取损伤部位处提取RNA，备用；步骤E:选用DNA芯片，与步骤D提取的RNA进行原位杂交，其中所述DNA芯片具有如下针对如下基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针:1)炎症反应相关:chemokine (C_C motif) ligandll、class II transactivator>interleukinlbeta、 selectin，platelet， tumor necrosis factor receptorsuperfamily, memberIb ；2)创伤应答相关:chemokine (C_C motif) ligandll、class IItransactivatorλ ypoxia-1nducible factorl, alpha subunit (basic helix-loop-helixtranscription factor)interleukinlbeta、selectin，platelet、tumor necrosis factorreceptor superfamily, memberIb ；3)免疫应答相关:chemokine (C-C motif) ligandll、class 11 transactivatorinterleukinlbetaλ phospholipid scramblasel、tumornecrosis factor receptor superfamily, memberlb ；4)防御应答相关:chemokine (C-Cmot if) I igandl 1、class II transact ivator Λ hypoxia-1nducible factorl、alphasubunit(basic helix-loop-helix transcriptionfactor)、interleukinlbeta、selectin，platelet、tumor necrosis factor receptorsuperfamily, memberlb ；5)血管生长相关:Kruppel-1ike factor5、hypoxia-1nduciblefactorl、alpha subunit (basichelix-loop-helix transcription factor)、interleukinlbeta、selectin, platelet ；6) 會泛量相关:ATPase,Ca2+transporting,cardiac muscle, slowtwitch2、class11 transactivatorλ hexokinase3 (white cell)、myosin,heavy chain7B，cardiacmuscle,beta phosphofructokinase, muscle phosphofructokinase, platelet，runtrelated transcription factorIΛsulfotransferase family, cytosoliclA, phenol-preferring, member I ;步骤F:采用基因芯片扫描仪进行扫描、获取扫描信号和数据，最后将信号和数据利用Quantile算法进行归一化处理。
[0007]本发明中，优选的方案为所述F步骤为:利用Agilent MicroarrayScanner (Cat#G2565CA, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)进行扫描；其中扫描仪软件设置为:Dye channel: Green, Scan resolution=5 μ m, PMT100%, 10%, 16bit ;然后用 Feature Extraction softwarel0.7(Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)软件读取数据和信号；最后米用 Gene Spring Software 11.0 (Agilent technologies, SantaClara, CA, US)软件进行归一化处理,所用的算法为Quantile。
[0008]本发明中，跌打镇痛膏优选广州白云山制药股份有限公司何济公制药厂生产的“701跌打镇痛膏”。
[0009]与传统的跌打镇痛膏药效检测相比，本发明的优点是:本发明利用基因芯片技术，采用新西兰家兔作为软组织损伤模型的获取对象，然后利用仪器进行扫描、检测、数据处理，根据数据了解了跌打镇痛膏的作用机制和功效，与传统的采用肉眼或显微镜观察，具有明显的进步；同时该检测方法快速、简便，经过 申请人:大量实验筛选出的实验参数和探针组合，能够使得检测结果更为准确。
[0010]下面结合附图及【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0011]附图
[0012]图1:实施例1所用基因芯片扫描图；
[0013]图2:实施例1所测得的箱线图；
[0014]图3:实施例1所测得的散点图；
[0015]图4:实施例1所测得的火山图；
【具体实施方式】
[0016]实施例1
[0017]一种利用基因芯片检测跌打镇痛膏药效的方法，依次包括如下步骤:
[0018]A:取一家兔，然后采用重锤坠落法制备软组织损伤模型:选用重量为Ikg的重锤，从家兔后退根部软组织的垂直上方20cm处自由落下，获得软组织损伤模型；步骤B:在A步骤完成的24小时后，测量家兔软组织损伤评分，其中测定痛阀采用的仪器为压痛仪，红肿范围不小于I平方厘米；步骤C:在家兔的损伤部位贴上跌打镇痛膏，其中跌打镇痛膏为广州白云山制药股份有限公司何济公制药厂生产的“701跌打镇痛膏”；步骤D:在家兔的取损伤部位处提取RNA，备用；步骤E:选用DNA芯片，与步骤D提取的RNA进行原位杂交，其中所述DNA芯片具有如下针对如下基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针:I)炎症反应相关:chemokine (C_C motif) ligandll、class II transactivator>interleukinlbeta、 selectin，platelet， tumor necrosis factor receptorsuperfamily, memberlb ；2)创伤应答相关:chemokine (C_C motif) ligandll、class IItransact ivator λ ypoxia-1nducible factorl, alpha subunit (basic helix-loop-helixtranscription factor)interleukinlbeta、selectin，platelet、tumor necrosis factorreceptor superfamily, memberlb ；3)免疫应答相关:chemokine (C-C motif) ligandll、class IItransactivatorinterleukinIbetphospholipid scramblasel、 tumornecrosis factorreceptor superfamily, memberlb ；4)防御应答相关:chemokine (C-Cmotif)ligandll、class 11 transactivatorΛhypoxia-1nducible factorl、alphasubunit(basichelix-loop-helix transcription factor)、 interleukinlbeta、selectin，platelet、tumornecrosis factor receptor superfamily, memberlb ；5)血管生长相关:Kruppel_likefactor5、hypoxia-1nducible factorl、alpha subunit (basichelix-loop-helixtranscription factor)、 interleukinlbeta、 selectin，platelet ；6) 會泛量 相关:ATPase，Ca2+transporting，cardiac muscle, slow twitch2、class11 transact ivator λ hexokinase3 (white cell)、myosin, heavy chain7B，cardiacmuscle,beta phosphofructokinase, muscle phosphofructokinase, platelet，runtrelated transcription factorl、sulfotransferase family，cytosoliclA,pheno1-preferring, memberl ；步骤 F:利用 Agilent Microarray Scanner(Cat#G2565CA,Agilent technologies, Santa Clara, CA，US)进行扫描；其中扫描仪软件设置为:Dyechannel: Green, Scan resolution=5 μ m，PMT100%，10%，16bit ;然后用 Feature Extractionsoftwarel0.7 (Agilenttechnologies, Santa Clara, CA，US)软件读取数据和信号；最后米用 Gene SpringSoftwarell.0 (Agilent technologies, Santa Clara，CA，US)软件进行归一化处理，所用的算法为Quantile。
[0019] 实施例2
[0020]一种利用基因芯片检测跌打镇痛膏药效的方法，依次包括如下步骤:
[0021]A:取一家兔，然后釆用重锤坠落法制备软组织损伤模型:选用重量为Ikg的重锤，从家兔后退根部软组织的垂直上方20cm处自由落下，获得软组织损伤模型；步骤B:在A步骤完成的24小时后，测量家兔软组织损伤评分，其中测定痛阀釆用的仪器为压痛仪，红肿范围不小于I平方厘米；步骤C:在家兔的损伤部位贴上跌打镇痛膏，其中跌打镇痛膏为广州白云山制药股份有限公司何济公制药厂生产的“701跌打镇痛膏”；步骤D:在家兔的取损伤部位处提取RNA，备用；步骤E:与步骤D提取的RNA进行原位杂交，其中所述DNA芯片具有如下针对如下基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针:1)炎症反应相关:chemokine (C-C motif)ligandll、 class II transactivatorΛ interleukinlbeta、 selectin，platelet、 tumornecrosis factor receptor superfamily, memberlb ；2)仓丨J 伤应答相关:chemokine (C-Cmot if)Iigandl1、class 11 transactivatorΛ ypoxia-1nducible factorl,alphasubunit (basic helix-loop-helix transcription factor)interleukinlbeta、selectin，platelet、tumor necrosis factor receptor superfamily, memberlb ；3)免疫应答相关！interleukinlbeta、phospholipid scramblasel、tumor necrosis factorreceptorsuperfamily，memberlb、Csf2、Tnfrsf6 ；4)防御应答相关:chemokine (C_Cmotif) ligandll、class II transact ivator Λ hypoxia-1nducible factorl、alphasubunit(basichelix-loop-helix transcription factor)、 interleukinlbeta、selectin，platelet、tumornecrosis factor receptor superfamily, memberlb ；5)血管生长相关:Kruppel_likefactor5、hypoxia-1nducible factorl、alpha subunit (basichelix-loop-helixtranscription factor)、 interleukinlbeta、 selectin，platelet ；6) 會泛量 相关:ATPase，Ca2+transporting，cardiac muscle, slow twitch2、class11 transact ivator λ hexokinase3 (white cell)、myosin, heavy chain7B，cardiacmuscle，beta、phosphofructokinase，muscle、phosphofructokinase,、platelet、runtrelated transcription factorl、 sulfotransferase family,cytosolic,IAjpheno1-preferring, memberl ；步骤 F:利用 Agilent Microarray Scanner (Cat#G2565CA,Agilent technologies, Santa Clara, CA，US)进行扫描；其中扫描仪软件设置为:Dyechannel: Green, Scan resolution=5 μ m，PMT90%，10%，15bit ;然后用 Feature Extractionsoftwarel0.7 (Agilenttechnologies, Santa Clara, CA，US)软件读取数据和信号；最后米用 Gene SpringSoftwarell.0 (Agilent technologies, Santa Clara，CA，US)软件进行归一化处理，所用的算法为Quantile。
[0022]实施例3[0023]一种利用基因芯片检测跌打镇痛膏药效的方法，依次包括如下步骤:
[0024]A:取一家兔，然后釆用重锤坠落法制备软组织损伤模型:选用重量为Ikg的重锤，从家兔后退根部软组织的垂直上方20cm处自由落下，获得软组织损伤模型；步骤B:在A步骤完成的24小时后，测量家兔软组织损伤评分，其中测定痛阀釆用的仪器为压痛仪，红肿范围不小于I平方厘米；步骤C:在家兔的损伤部位贴上跌打镇痛膏，其中跌打镇痛膏为广州白云山制药股份有限公司何济公制药厂生产的“701跌打镇痛膏”；步骤D:在家兔的取损伤部位处提取RNA，备用；步骤E:l)炎症反应相关:chemokine (C_C motif) ligandll、class 11 transact ivator Λ interleukinlbeta、selectin，platelet、tumor necrosis factor receptorsuperfamily, memberlb ；2)创伤应答相关:Vegefa、Gnrh2、ypoxia-1nducible factorl, alpha subunit (basichelix-loop-helix transcription factor)interleukinlbeta、selectin，platelet、tumornecrosis factor receptor superfamily, memberlb ；3)免疫应答相关:chemokine (C-Cmotif)ligandll、 RTl-Bb、 interleukinlbeta、 phospholipid scramblasel、 tumornecrosis factor receptor superfamily, memberlb ；4)防御应答相关:chemokine (C-Cmotif)ligandll、class 11 transactivatorΛhypoxia-1nducible factorl、alphasubunit (basic helix-loop-helix transcriptionfactor)、interleukinlbeta、selectin，platelet、tumor necrosis factor receptorsuperfamily, memberlb ；5)血管生长相关:Kruppel-1ike factor5、hypoxia-1nduciblefactorlΛ alpha subunit (basichelix-loop-helix transcription factor)、interleukinlbeta、selectin, platelet ；
6)會泛量相关:ATPase,Ca2+transporting,cardiac muscle, slowtwitch2、class11 transact ivator λ hexokinase3 (white cell)、myosin, heavy chain7B，cardiacmuscle, beta、phosphofructokinase, muscle、phosphofructokinase, platelet、runtrelated transcription factorl、sulfotransferase family，cytosolic，IAjpheno1-preferring, memberl ；步骤 F:利用 Agilent Microarray Scanner (Cat#G2565CA,Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)进行扫描；其中扫描仪软件设置为:Dyechannel: Green, Scan resolution=5 μ m，PMT95%，10%，18bit ;然后用 Feature Extractionsoftwarel0.7 (Agilent technologies, Santa Clara, CA，US)软件读取数据和信号；最后米用 Gene Spring Softwarell.0 (Agilent technologies, Santa Clara，CA，US)软件进行归一化处理，所用的算法为Quantile。
[0025]实施例4
[0026]一种利用基因芯片检测跌打镇痛膏药效的方法，依次包括如下步骤:A:取一家兔，然后釆用重锤坠落法制备软组织损伤模型:选用重量为Ikg的重锤，从家兔后退根部软组织的垂直上方30cm处自由落下，获得软组织损伤模型；步骤B:在A步骤完成的24小时后，测量家兔软组织损伤评分，其中测定痛阀釆用的仪器为压痛仪，红肿范围不小于I平方厘米；步骤C:在家兔的损伤部位贴上跌打镇痛膏，其中跌打镇痛膏为广州白云山制药股份有限公司何济公制药厂生产的“701跌打镇痛膏”；步骤D:在家兔的取损伤部位处提取RNA，备用；步骤E:与步骤D提取的RNA进行原位杂交，其中所述DNA芯片具有如下针对如下基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针:1)炎症反应相关:chemokine (C-Cmotif) ligandll、class 11 transact ivator Λ interleukinlbeta、selectin，platelet、tumornecrosis factor receptor superfamily, memberlb ；2)创伤应答相关:Lcn2、Bag3、class II transactivator、ypoxia-1nducible factorl, alphasubunit (basic helix-loop-helixtranscription factor)interleukinlbeta、selectin，platelet、tumor necrosis factorreceptor superfamily, memberlb ；3)免疫应答相关:chemokine(C-C motif)ligandll、Spn、F3、Ccl5、interleukinlbeta、phospholipid scramblasel、tumor necrosisfactor receptor superfamily, memberlb ；
4)防御应答相关:chemokine (C_C motif) ligandll、class II transactivator、hypoxia-1nducible factorl、alpha subunit (basichelix-loop-helix transcriptionfactor)、interleukinIbeta λ selectin，platelet、tumornecrosis factor receptorsuperfamily, memberlb ；5)血管生长相关:Kruppel_likefactor5、hypoxia-1nduciblefactorl、 alpha subunit(basic helix-loop-helixtranscription factor)、interleukinlbeta、selectin, platelet ；6)會泛量相关:ATPase, Ca2+transporting, cardiacmuscle,slow twitch2、class II transactivator、myosin,heavychain7B, cardiacmuscle，beta、phosphofructokinase，muscle、phosphofructokinase,、platelet、runtrelated transcription factorl、sulfotransferase family，cytosolic，IAjpheno1-preferring, memberl ；步骤 F:利用 Agilent Microarray Scanner (Cat#G2565CA,Agilent technologies, Santa Clara, CA，US)进行扫描；其中扫描仪软件设置为:Dyechannel: Green, Scan resolution=5 μ m，PMT100%，8%，14bit ;然后用 Feature Extractionsoftwarel0.7 (Agilent technologies, Santa Clara, CA，US)软件读取数据和信号；最后米用 Gene Spring Softwarell.0 (Agilent technologies, Santa Clara，CA，US)软件进行归一化处理，所用的算法为Quantile。
[0027]实施例5 [0028]根据实施例1的检测方法，检测出701跌打镇痛膏的靶基因为302个，上调的基因有193个，下调的基因有109个。对靶基因进行GO分析表明，与炎症和应激有关的基因表达下调，再生和多细胞组织生长的基因表达上调。此外，微血管形成基因及骨化基因等上调。对靶基因的Pathway分析结果表明，差异基因的信号通路主要与IL-1R信号通路、白细胞粘附信号通路等炎症因子通路有关，此外还有T细胞受体信号通路、MAPK信号通路、核酸受体毒物代谢通路等有关，此通路与药物的作用途径有关。
[0029]I)芯片差异基因数据(701与模型组相比)
[0030]
【权利要求】
1.一种利用基因芯片检测跌打镇痛膏药效的方法，其特征在于依次包括如下步骤:A:取一家兔，然后釆用重锤坠落法制备软组织损伤模型:选用重量为Ikg的重锤，从家兔后退根部软组织的垂直上方20cm处自由落下，获得软组织损伤模型；步骤B:在A步骤完成的24小时后，测量家兔软组织损伤评分，其中测定痛阀釆用的仪器为压痛仪，红肿范围不小于I平方厘米；步骤C:在家兔的损伤部位贴上跌打镇痛膏；步骤D:在家兔的取损伤部位处提取RNA，备用；步骤E:选用DNA芯片，与步骤D提取的RNA进行原位杂交，其中所述DNA芯片具有针对如下基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针: 1)炎症反应相关:chemokine(C_C motif) IigandlK class II transactivator、interleukinlbeta、 selectin，platelet， tumor necrosis factor receptorsuperfamily, memberIb ； 2)创伤应答相关:chemokine(C-C motif) IigandlK class II transactivator、ypoxia-1nducible factorl，alpha subunit (basic helix-loop-helix transcriptionfactor) interleukinlbeta、 selectin，platelet、 tumor necrosis factor receptorsuperfamily, memberIb ； 3)免疫应答相关:chemokine(C_C motif) ligandll、class II transactivator interleukinlbeta、 phospholipid scramblasel、 tumor necrosis factorreceptorsuperfamily, memberIb ； 4)防御应答相关:chemokine(C_C motif) ligandll、class II transactivator、hypoxia-1nducible factorl、alpha subunit (basic helix-loop-helixtranscriptionfactor)、interleukinlbeta、selectin, platelet、tumor necrosis factorreceptorsuperfamily, memberIb ； 5)血管生长相关:Kruppel-1ikefactor5、hypoxia-1nducible factorl、alphasubunit(basic helix-loop-helix transcription factor)、 interleukinlbeta、selectin, platelet ； 6)會泛量相关:ATPase，Ca2+transporting，cardiacmuscle, slow twitch2、classIItransactivator、hexokinase3(white cell)、myosin,heavy chain7B，cardiacmuscle,beta phosphofructokinase，muscle phosphofructokinase，platelet，runtrelatedtranscription factorl、sulfotransferase family, cytosoliclA, phenol-preferring，memberI ； 步骤F:釆用基因芯片扫描仪进行扫描、获取扫描信号和数据，最后将信号和数据利用Quantile算法进行归一化处理。
2.根据权利要求1所述的利用基因芯片检测跌打镇痛膏药效的方法，其特征在于所述F步骤为:
利用 Agilent Microarray Scanner(Cat#G2565CA, Agilent technologies,SantaClara, CA，US)进行扫描；
其中扫描仪软件设置为:Dye channel:Green, Scan resolution=5 μ m，PMT100%，10%，I6bit ； 然后用 Feature Extraction softwarel0.7(Agilent technologies, SantaClara, CA, US)软件读取数据和信号；
最后米用 Gene Spring Software 11.0 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)软件进行归一化处理，所用的算法为QuantiIe。
3.根据权利要求1或2所述的利用基因芯片检测跌打镇痛膏药效的方法，其特征在于:所述跌打镇痛膏为广州白云山制药股份有限公司何济公制药厂生产的跌打镇痛膏。
【文档编号】C12Q1/68GK103911448SQ201410132129
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】邓慧敏, 杨威, 黄杰伟, 符美燕, 肖百全, 郭秋平 申请人:广州白云山制药股份有限公司白云山何济公制药厂