一种采用全细胞转化高效生产α-酮戊二酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种采用全细胞转化高效生产α-酮戊二酸的方法，以枯草芽孢杆菌表达通过易错PCR或定点饱和突变改造的L-氨基酸脱氨酶基因，提高全细胞转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸的转化率，L-氨基酸脱氨酶基因基因序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。此提高了转化率的全细胞转化体系的建立，解决了化学法合成α-酮戊二酸的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题及酶法转化生产α-酮戊二酸的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产α-酮戊二酸，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。
【专利说明】—种采用全细胞转化高效生产α-酮戊二酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种采用全细胞转化高效生产α -酮戊二酸的方法，特别是一种通过易错PCR和定点饱和突变改造L-氨基酸脱氨酶基因，提高了重组枯草芽孢杆菌全细胞转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸的转化率。
【背景技术】
[0002]α -酮戊二酸是三羧酸循环的重要中间体，对于协调细胞内碳代谢和氮代谢发挥重要作用。α -苯丙酮酸有很多应用，可用来合成抗肿瘤药物的杂环化合物，可作为抗氧化剂及促进伤口愈合。在生物医学诊断中，α-酮戊二酸可作为酮戊二酸脱氢酶，天冬氨酸转氨酶及丙氨酸转氨酶的底物。α -酮戊二酸可作为合成聚乙烯的原材料，这种聚合物具有生物降解能力。传统α-酮戊二酸生产采用化学法，化学法的主要缺点是缺乏选择性，采用有毒的氰化物及金属铜，产率低，且污染环境。酶和全细胞生物催化剂越来越多的用于工业化生产。[0003]L-氨基酸脱氨酶(EC1.4.3.2)催化L-氨基酸氧化脱氨基，生成相应α -酮酸和氨，多为黄素蛋白，二聚体结构。L-氨基酸脱氨酶主要存在于蛇毒和昆虫毒素中，在细菌、真菌、藻类中也存在。蛇毒氨基酸脱氨酶是研究最好的脱氨酶，但是价格昂贵，难以大规模使用。P.mirabilisKCTC2566有两种L-氨基酸脱氨酶，一种具有广泛的底物特异性，能够催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其对L-苯丙氨酸具有较高催化活性；另一种具有底物限制性，只对碱性氨基酸具有催化活性，尤其是L-组氨酸。大部分细菌L-氨基酸脱氨酶是胞外分泌型，但是P.mirabilis中两种L-氨基酸脱氨酶都是膜蛋白。
[0004]定向进化已被广泛应用于研究蛋白质结构和功能关系及提高酶的特征。理性及半理性蛋白质工程已用于提高酶的特性，比如对映选择性、活性或稳定性。通过定点饱和突变或迭代突变对这些突变位点进行研究，进一步提高酶的特性。
[0005]全细胞转化相比分离酶具有如下优势:全细胞生物催化剂更容易制备，成本低；比分离酶更稳定，不易受环境温度、PH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物。有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化PPA生产。之前的研究中我们已经成功构建了枯草芽孢杆菌全细胞催化剂，表达来源于P.mirabilisKCTC2566的脱氨酶，转化率为26%，转化效率较低。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种高效生产α-酮戊二酸的方法，是将来源于P.mirabilisKCTC2566的第二种脱氨酶基因进行易错PCR或定点饱和突变改造，转化枯草芽孢杆菌构建全细胞催化剂，以此菌株高效转化L-谷氨酸生产α -酮戊二酸，从而解决了工业化α -酮戊二酸生产高成本、低得率、污染严重的问题。
[0007]所涉及到的微生物有:P.mirabilis KCTC2566、Ε.coli JM109、B.subtilisl68。
[0008]所述L-氨基酸脱氨酶基因(pml)的易错PCR扩增方法为:以构建的重组质粒pET-pml为模板,Mutazyme II DNA polymerase低保真酶扩增pml基因。PCR产物纯化、酶切后，与载体pET-20b (+)连接，构建重组质粒，转化大肠杆菌JM109构建突变体文库。挑取氨苄抗性平板上生长的单菌落接种到LB，在96孔板中37°C震荡过夜培养，接种到另一块96孔板的TB培养基中，IPTG诱导5h。
[0009]所述L-氨基酸脱氨酶基因(pml)的定点突变方法为:以构建的重组质粒pET-pml为模板，Prime-STAR HS DNA polymerase高保真酶及设计的突变引物一步法扩增，DpnI限制性内切酶消化模板DNA，然后磷酸化，连接为全质粒，转化枯草芽孢杆菌168。
[0010]通过易错PCR或定点饱和突变改造获得的L-氨基酸脱氨酶基因序列如SEQ IDN0.1所示或SEQ ID N0.2所示。
[0011]SEQ ID N0.1
[0012]ATGGCAATAAGTAGAAGAAAATTTATTCTTGGTGGCACAGTGGTTGCTGTTGCTGCAGGCGCTGGGGTTTTAACACCTATGTTAACGCGAGAAGGGCGTTTTGTTCCTGGTACGCCGAGACATGGTTTTGTTGAGGGAACTGGCGGTCCATTACCGAAACAAGATGATGTTGTTGTAATTGGTGCGGGTATTTTAGGTATCATGACCGCGATTAACCTTGCTGAGCGTGGCTTATCTGTCACAATCGTTGAAAAAGGAAATATTGCCGGCGAACAATCATCTCGATTCTATGGTCAAGCTATTAGCTATAAAATGCCAGATGAAACCATCTTATTACATCACCTCGGGAAGCACCGCTGGCGTGAGATGAACGCTAAAGTTGGTATTGATACCACTTATCGTACACAAGGTCGTGTAGAAGTTCCTTTAGATGAAGAAGATTTAGAAAACGTAAGAAAATGGATTGATGCTAAAAGCAAAGATGTTGGCTCAGACATTCCATTTAGAACAAAAATGATTGAAGGCGCTGAGTTAAAACAGCGTTTACGTGGCGCTACCACTGATTGGAAAATTGCTGGTTTCGAAGAAGACTCAGGAAGCTTCGATCCTGAAGTTGCGACTTTTGTGATGGCAGAATATGCCAAAAAAATGGGTATCAAAATTTTCACAAACTGTGCAGCCTTTGGTTTAGAAACGCAAGCTGGTGTTATTTCTGATGTTGTAACAGAAAAAGGACCAATTAAACTCTCTCGTGTTGTTGTCCGCGGTGGTGTTGGGTCACGTTTATTTATGCAGAACCTAAATGTTGATGTACCAACATTACCTGCTTATCAATCACAGCAATTAATTAGCGCAGCACCAAATGCGCCAGGTGGAAACGTTGCTTTACCCGGCGGAATTTTCTTTCGTGATCAAGCGGATGGAACGTATGCAACTTCTCCTCGTGTCATTGTTGCTCCGGTAGTAAAAGAATCATTTACTTACGGCTATAAATATTTACCTCTGCTGGCTTTACCTGATTTCCCAGTACATATTTCGTTAAATGATCAGTTGGCTAATTCCTTTATGCAATCAACACATTGGGATCTTAATGAAGAGTCGCCATTTGAAAAATATCGTGATATGACCGCTCTGCCTGATCTGCCAGAATTAAATGCCTCACTGGAAAAACTGAAAAAAGAGTTCCCAGC
[0013]SEQ ID N0.2
[0014]ATGGCAATAAGTAGAAGAAAATTTATTCTTGGTGGCACAGTGGTTGCTGTTGCTGCAGGCGCTGGGGTTTTAACACCTATGTTAACGCGAGAAGGGCGTTTTGTTCCTGGTACGCCGAGACATGGTTTTGTTGAGGGAACTGGCGGTCCATTACCGAAACAAGATGATGTTGTTGTAATTGGTGCGGGTATTTTAGGTATCATGACCGCGATTAACCTTGCTGAGCGTGGCTTATCTGTCACAATCGTTGAAAAAGGAAATATTGCCGGCGAACAATCATCTCGATTCTATGGTCAAGCTATTAGCTATAAAATGCCAGATGAAACCATCTTATTACATCACCTCGGGAAGCACCGCTGGCGTGAGATGAACGCTAAAGTTGGTATTGATACCACTTATCGTACACAAGGTCGTGTAGAAGTTCCTTTAGATGAAGAAGATTTAGAAAACGTAAGAAAATGGATTGATGCTAAAAGCAAAGATGTTGGCTCAGACATTCCATTTAGAACAAAAATGATTGAAGGCGCTGAGTTAAAACAGCGTTTACGTGGCGCTACCACTGATTGGAAAATTGCTGGTTTCGAAGAAGACTCAGGAAGCTTCGATCCTGAAGTTGCGACTTTTGTGATGGCAGAATATGCCAAAAAAATGGGTATCAAAATTTTCACAAACTGTGCAGCCTGCGGTTTAGAAACGCAAGCTGGTGTTATTTCTGATGTTGTAACAGAAAAAGGACCAATTAAATCTTCTCGTGTTGTTGTCACCGGTGGTGTTGGGTCACGTTTATTTATGCAGAACCTAAATGTTGATGTACCAACATTACCTGCTTATCAATCACAGCAATTAATTAGCGCAGCACCAAATGCGCCAGGTGGAAACGTTGCTTTACCCGGCGGAATTTTCTTTCGTGATCAAGCGGATGGAACGTATGCAACTTCTCCTCGTGTCATTGTTGCTCCGGTAGTAAAAGAATCATTTACTTACGGCTATAAA
TATTTACCTCTGCTGGCTTTACCTGATTTCCCAGTACATATTTCGTTAAATGATCAGTTGGCTAATTCCTTTATGCA
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TGCAACAGGTTGGGGAATGACTGAAAGCCCTGTATCAGCAGAAATTACAGCAGATTTATTATTAGGCAAAAAACCAG
TATTAGATGCCAAACCATTTAGTCTGTATCGTTTCTAA
[0015]改造获得的L-氨基酸脱氨酶基因编码突变体为F110I/A255R/E31D/R228F/T249L/I351T 或 F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T。
[0016]所述微生物菌株的种子培养与发酵培养基:种子培养基:蛋白胨lg，酵母粉0.5g，NaCllg,自来水定容至100mL。发酵培养基:蛋白胨12g,酵母提取物24g,甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60°C，再加IOOmL灭菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54g的K2HPO4溶于水中，终体积为IOOmL,高压灭菌)。
[0017]本发明的有益效果:本发明成功实现了 P.mirabilis中L-氨基酸脱氨酶的改造，提高了利用枯草芽孢杆菌重组细胞转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸的转化率。得到的易错PCR突变体为Fl 10I/A255R/E31D/R228F/T249L/I351T,全细胞转化L-谷氨酸生产α -酮戊二酸的转化率为59.72%，定点饱和突变得到的突变体F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/Ι351Τ，全细胞转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸的转化率为85.25%。此提高了转化率的全细胞转化体系的建立，解决了化学法合成α -酮戊二酸的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题及酶法转化生产α-酮戊二酸的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产α -酮戊二酸，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。
【具体实施方式】
[0018]材料与方法
[0019]种子培养基:蛋白胨lg，酵母粉0.5g, NaCllg,自来水定容至100mL。
[0020]发酵培养基:蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到 60°C，再加 IOOmL 灭菌的 17mmol/L KH2PO4 和 72mmol/LK2HP04 的溶液。
[0021]α-酮戊二酸含量测定:将转化体系进行离心，弃上清，离心向细胞中加入50 μ IL-谷氨酸(IOOmM)，30min后，加入45 μ I三氯乙酸(20%)，室温放置30min，终止反应。加入20yL DNP (20mM)，室温放置15min，加入400 μ L NaOH (0.8Μ)终止反应。离心，取上清，酶标仪测定520nm的吸光度。
[0022]实施例1易错PCR对L-氨基酸脱氨酶进行改造
[0023]以构建的重组质粒pET-pml [I]为模板,Mutazyme II DNA polymerase低保真酶扩增pml基因。PCR产物纯化、酶切后，与载体pET-20b(+)连接，构建重组质粒，转化大肠杆菌JM109构建突变体文库。挑取氨苄抗性平板上生长的单菌落接种到LB，在96孔板中37°C震荡过夜培养，接种到另一块96孔板的TB培养基中，IPTG诱导5h。进行筛选后，对酶活高的菌株提取质粒，转化B.subtilisl68，构建全细胞催化剂，进一步测试转化率。转化率高的菌株，提取质粒，作为下一轮易错PCR的模板。经过三轮易错PCR得到了转化率较高的突变体
[0024]F110I/A255R/E31D/R228F/T249L/I351T。[0025][l]Hossain GS, Li J, Shin H-d, Chen RR, Du G, Liu L, Chen J.Bioconversion ofL-glutamic acid to a-ketoglutaric acid by an immobilized whole-cell biocatalystexpressing L—amino acid deaminase from Proteus mirabilis.J Biotechnol2013.[0026]实施例2定点突变对L-氨基酸脱氨酶进行改造
[0027]对实施例1得到的突变位点逐个进行定点饱和突变，以构建的重组质粒pET-pml为模板，Prime-STAR HS DNA polymerase高保真酶及设计的突变引物一步法扩增，DpnI限制性内切酶消化模板DNA，然后磷酸化，连接为全质粒，转化枯草芽孢杆菌168。每个位点产量最高的突变体为:F110I，A255T，E31D，R228C，L249S，I351T。将这几个突变位点组合在一起，构建 F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T。
[0028]实施例3全细胞催化剂的制备及全细胞转化过程
[0029]实施例1和实施例2的重组枯草芽孢杆菌168接种种子培养基(氯霉素IOmg/L)，37°C，200rpm过夜培养。发酵在3L NBS发酵罐中进行，1%接种量到1.8L发酵培养基中，搅拌转速、通气量和温度分别为400rpm、l.0vvm和28。。，当OD600达到0.6，加入0.4mMIPTG诱导L-氨基酸脱氨酶表达。诱导5h后，8，OOOrpm低温离心10min，收集菌体，用20mMTris-HCl (pH8.0)缓冲液洗两遍菌体。全细胞转化体系为:L_谷氨酸15g/L，全细胞催化剂20.0g/L,反应在 20mMTris-HCl (pH8.0)中进行，37°C，200rpm 转化 24h。
[0030]F110I/A255R/E31D/R228F/T249L/I351T，全细胞转化L-谷氨酸生产 α-酮戊二酸的转化率为59.72%，定点饱和突变得到的突变体F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T，全细胞转化L-谷氨酸生产α -酮戊二酸的转化率为85.25%。
[0031]虽然本发明已 以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种采用全细胞转化高效生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于以枯草芽孢杆菌表达通过易错PCR或定点饱和突变改造的L-氨基酸脱氨酶基因，提高全细胞转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸的转化率。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述枯草芽孢杆菌为168。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述L-氨基酸脱氨酶基因基因序列如SEQ ID N0.1 所示。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述L-氨基酸脱氨酶基因基因序列如SEQ ID N0.2 所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述易错PCR方法:使用MutazymeIIDNApolymerase低保真酶扩增L-氨基酸脱氨酶基因，产生随机突变，克隆到表达载体pET20b+，转化大肠杆菌JM109进行筛选。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述定点饱和突变方法:使用Prime-STARHS DNA polymerase高保真酶及设计的突变引物一步法扩增,然后磷酸化及自连接为全质粒，转化枯草芽孢杆菌168。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述改造的脱氨酶基因编码突变体为F110I/A255R/E31D/R228F/T249L/I351T。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述改造的脱氨酶基因编码突变体为F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T。
【文档编号】C12R1/125GK103911400SQ201410132063
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】陈坚, 刘龙, 堵国成, 李江华, 嘎子·侯赛因, 侯颖 申请人:江南大学