狂犬病病毒ctn鸡胚细胞适应株的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种狂犬病病毒CTN鸡胚细胞适应株，其微生物保藏号为：CGMCC?No.6510；本发明还提供了所述的狂犬病病毒CTN鸡胚细胞适应株在制备狂犬病病毒灭活疫苗中的用途。狂犬病病毒CTN鸡胚细胞适应株具有新的碱基和氨基酸序列，能在CEC上产生高病毒滴度，具有较高的免疫原性，可用于生产狂犬病疫苗、制备抗RV抗体以及检测RV抗体效价等；本发明还测定了该毒株的5个结构蛋白及全基因序列；此外本发明还提供了RV?CTNCEC25株的灭活原疫苗，具有良好的免疫保护性，其效力可达到当前市售疫苗水平，符合药典标准。
【专利说明】狂犬病病毒CTN鸡胚细胞适应株
【技术领域】
[0001]本发明主要涉及一种新的狂犬病病毒株，具体涉及一种狂犬病病毒鸡胚细胞适应株。
【背景技术】
[0002]狂犬病病毒(Rabies virus, RV)是高度嗜神经病毒，为弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssavirus genus)中不分节段的单股负链RNA病毒，能引起人兽共患的世界性传染病一狂犬病。据报道全世界每年因狂犬病的死亡人数约有
5.5万例，实际死亡人数应明显高于该统计数字(http://www.worldrabiesday.0rg/)。目前除日本、英国、夏威夷等少数国家和地区没有狂犬病发生以外，该病呈世界性流行，其中亚洲和非洲是人狂犬病发生最严重的地区，占全世界死亡总人数的99%。在正式报告狂犬病的国家中，印度每年有3万人以上死于狂犬病，居首位；我国近20年每年统计到的死亡人数超过 3000 例，居第二位(Yunpeng wang et al., 2012.Journal of AppliedVirology.1:10-19)。目前狗仍然是人狂犬病的最重要的宿主。
[0003]RV基因组大小约12kb，由3'端至5'端依次排列着5个RV结构蛋白基因，分别编码五种已知的结构蛋白:核蛋白(N)、憐蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA多聚酶(L)。N蛋白在RV复制过程中与RNA结合成核糖核酸蛋白(RNP) ;L蛋白和磷蛋白与RNP紧密相连呈螺旋状结构，确保基因组在细胞质中转录和复制；M蛋白是一种连接蛋白，为RV5种结构蛋白中变异较大的蛋白质之一，其占据了核衣壳和外壳之间的位置，并将两者连接一起；G蛋白是RV中唯一暴露在病毒粒子表面和诱导宿主产生中和抗体的蛋白，其羧基端插入RNP中，负责与宿主细胞表面的受体的结合。
[0004]G蛋白由G基因编码，共有1675个核苷酸，编码524个氨基酸。G蛋白是RV的主要保护性抗原，能诱导机体产生中和抗体,`保护机体抵抗RV的感染(Wiktor et al.，1973.J.1mmunol.110:269-276 ；Cox et al.,1977.1nfect.1mmun.16:754-759 ；Perrin et al.，1985.Vaccine.3:325-332) 0当前无论人用还是兽用狂犬病疫苗，其效价主要取决于疫苗制剂中G蛋白的含量。G蛋白上至少存在3个中和抗体结合位点:抗原位点III (antigen III,G III)、抗原位点 II (antigen II, G II)及次要抗原位点 I (antigen I, G I),其中 G II位于34-200氨基酸区段，G III位于330-357位氨基酸区段(Tordo N., 1996.Laboratorytechniques in rabies.4th ed.WHO:28_49)。G II和GIII不但是诱导产生中和抗体的抗原表位，而且也是G蛋白折叠和运输的必需部分。研究表明G蛋白抗原性变化主要是由G II位点上34-42位、147位、184位、198-200位氨基酸以及GIII位点上330-340位氨基酸的替换引起(Benmansour etal., 1991.J.virol.65:4198-4203)。G 蛋白上单一氨基酸的改变就能改变RV的抗原性。Irie等用单克隆抗体研究RV G蛋白上的I个构象表位时发现,第36位苏氨酸被脯氨酸替换形成的突变株丢失了这一抗原表位，单克隆抗体不能中和该突变株；第39位丝氨酸被苏氨酸替换形成的突变株虽能与单克隆抗体结合，但其空间构象发生了改变，单克隆抗体也不能中和突变株(Irie T et al., 2002.Microbiol.1mmunol.46:449-461 )0其他研究者利用抗G II抗原位点的单克隆抗体研究G蛋白的抗原性也得到过类似的结果。G蛋白的结构与RV毒力有关。研究发现，当RV G糖蛋白膜外区330位的赖氨酸和333位的精氨酸分别被天门冬氨酸和甲硫氨酸取代会明显降低糖蛋白和神经瘤细胞之间的相互作用，且形成的双突变RV株对成年小鼠没有致病性。其他研究也发现，当G蛋白的第333位精氨酸被异亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或甘氨酸替换，不管以何种剂量、何种途径感染小鼠，该突变毒株均无致病性(Dietzschold B.et al., 1983.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，80:70-74 ；Seif et al.，1985.J.Virol.53:926-934 ;Tuffereau et al.，1989.Virology,172:206-212 ；Ito H.et al.，1994.Microbiol.1mmunol.38:479-482:CoulonP et al.，1998.J.Virol.72:272-274 ;Mutsuyo Takayama-1to M.et al.,2006.Virusresearch, 119:208-215)。此外G蛋白的第164-303位氨基酸与RV对成年鼠的致死性作用有关，其中第242、255、268位氨基酸能增强RV的毒力。最新的研究发现，无致病性毒株的第194位天冬酰胺被赖氨酸替换，能增强RV突变株的传播，提高RV突变株的毒力(Takayama-1to M.et al.，2004.J.Neurovirol.10:131-135)。
[0005]由于RV是嗜神经性病毒，几乎对所有哺乳动物的神经组织都具有侵染性。世界上首次试用的狂犬病疫苗就是用RV感染兔脊髓研制的，以后经兔脑、小鼠脑、羊脑等动物神经组织培养，制备疫苗。但由于该类疫苗存在严重的变态反应且效力低而被WHO停用(林放涛等.1992.狂犬病学.203-221 ；Meslin F.X.et al., 1996.Laboratory techniques inrabies.4thed.WH0.223-313)。1956年Vienchange及其同事首次将RV在原代小鼠肾细胞上培养成功。2年后Kissling等将RV街毒株和固定毒株在原代地鼠肾细胞中传代(KissingP.E.et al., 1958.Proc.Soc Exp Biol Med.98:223-225)。20 世纪 60 年代以后用细胞制备疫苗有了很大发展，人们开始利用各种细胞来大规模生产狂犬病疫苗，特别是人二倍体细胞培养疫苗(HDCV)的研制(Wiktor et al., 1964.J Immunol.93:353-366)。由于不存在神经元组织，与之前的脑组织疫苗相比，组织培养疫苗不仅更安全，而且更有效。目前已批准若干种组织培养疫苗，其具有与HDCV相当的疗效和安全性。例如纯化鸡胚细胞疫苗(PCEC) (Barth etal., 1984.J Biol Stand.12:29-64;Schgal et al., 1993.J.Commun.Dis.27:36-43)和纯化 vero 细胞狂犬病疫苗(PVRV) (Suntharasamal et al., 1986.Lancet.2:129—131)。
[0006]RV CTN-1株是WHO和我国有关部门批准用于狂犬病疫苗生产的毒株，由中国食品药品检定研究院建株和保存。20世纪80年代李宏玲等将RV CTN-1株在vero细胞中培养进行适应传代，得到较高滴度的RV vero细胞适应株，可用于疫苗生产(李宏玲等.1989.生物制品学杂志.2:22-25)。董关木等进一步证实CTN-1株可在vero细胞内快速适应，滴度可到7.0logLD5cZml以上，并可多次收获病毒培养液(董关木等.1995.微生物学免疫学进展.23:82-85)。目前已有多家生产单位应用RV CTN-1株生产vero细胞疫苗并取得生产文号和投产(俞永新.2008.狂犬病和狂犬病疫苗.第二版.中国医药科技出版社.207-209)。但veix)细胞基质为永生性传代细胞系，因此有必要检测终产品中的细胞残留DNA (Ref.欧洲药典.2004 ;中国药典.2010)，因为其可能具有传递潜伏病毒和其他物质的风险。WHO也规定人用制品的残留DNA剂量应不超过IOng (WHO Expert Committee on BiologicalStandardition.Recommendations inactivated rabies vaccine for human use producedin cell substrates and embryonated eggs.Genava.WH0.2005)。[0007]Rudolph Barth等人(US4115195)描述了生产狂犬病疫苗的过程，其中多种RV毒株均可利用鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast cells, CEC)制备狂犬病疫苗,如VPll株、Pasteur株、PM株、Flury LEP和Flury HEP。他们在专利中具体提供了利用 RV 固定株 VPl1、Flury LEP 和 Flury HEP 感染 CEC 的实例。PATEL Pradip Maganlal和 PATEL Pankaj Ramanbhai (PCT/IN2008/000262)描述了 Pitman moore 株(Wistar 株PM-HDCS\1503-3M)适应于CEC，所得到的病毒株产量高且生产时间短，易于成规模生产。1984年底我国的陈道民和林放涛择用Flury (LEP)株68代鸡胚固定毒(兽用活疫苗株)适应到CEC培植人用狂犬病疫苗株，初步获得一株既能使用CEC又具有与a G株(3)免疫原性相仿的狂犬病鸡胚细胞适应株一武汉(Wuhan)34株(陈道民等.1988.中国人寿共患病杂志.4:28-30)，但未见到有关该适应毒株进一步的报道。王远征等人也尝试将RV aG株在CEC上进行传代适应，得到滴度可达7.0logLD5cZml的毒株，但该病毒株是否已完全适应于CEC尚不确定(王远征等.2012.中国生物制品学杂志.25:669-671)。迄今为止，还没有文献提及使CTN-1株适用于CEC。
【发明内容】
[0008]本发明提供了一种可在CEC上快速增殖，病毒滴度高、免疫原性好，但对成年小鼠的致病力大大减弱的狂犬病病毒CTN鸡胚细胞适应株；用狂犬病病毒CTN鸡胚细胞适应株生产狂犬病疫苗，不仅免疫原性和保护效果良好，而且在安全性方面更可靠，是生产狂犬病疫苗的理想毒株；此外狂犬病病毒CTN鸡胚细胞适应株具有良好的免疫保护性，可作为免疫原刺激机体产生较高水平的抗体水平,用以制备高质量的抗RV抗体。
[0009]本发明提供了一种狂犬病病毒CTN鸡胚细胞适应株，其微生物保藏号为:CGMCCN0.6510 ;本发明还提供了所述的狂犬病病毒CTN鸡胚细胞适应株在制备狂犬病病毒灭活疫苗中的用途。
[0010]总体来说，本发明具有以下特点:`[0011]第一方面，本发明提供了一种新的RV毒株，命名为RV CTN鸡胚细胞适应株即RVCTNCEC25株。该毒株具有新的碱基和氨基酸序列，能在CEC上产生高病毒滴度，具有较高的免疫原性，可用于生产狂犬病疫苗、制备抗RV抗体以及检测RV抗体效价等。
[0012]第二方面，本发明测定了该毒株的5个结构蛋白及全基因序列。本发明人利用分子生物学的方法，对该毒株的5个结构蛋白基因以及全基因序列进行分析，发现该毒株与母本CTN-1株相比，5个结构蛋白均有不同程度的变异，其中G蛋白变异最大。在G蛋白编码序列的7个变异的核苷酸中,6个位于G蛋白的编码序列区域(Coding sequences,⑶S),它们分别是 3812 位(A — G)、4371 位(G — A)、4538 位(G — A)、4635 位(C — A)、4636 位(A — G)和 4826 位(T — C)，对应的氨基酸分别是 147 位(Lys — Glu),333 位(Arg — Gin)、389 位(Glu-Lys)、421 位(Pro — Gln)和 485 位(Ser — Pro)。另外 5251 位核苷酸(C — A)位于G蛋白的link sequence区域，不影响G蛋白的氨基酸序列。
[0013]第三个方面，本发明提供了 RV CTNCEC25株的灭活原疫苗。用本发明的RVCTNCEC25 株毒种按照 MOI (multiple of infection,MOI )=0.001 ~0.05FFU/ 细胞的量接种CEC悬液，充分混悬后，置于33~35°C、5%C02培养，待80%以上的细胞病变即可收获病毒液。然后按照灭活剂与病毒液1:4000 (v/v)的比例加入丙内酯灭活制备原疫苗，用于免疫12~14g的小鼠，分别进行免疫原性检查和效力测试。结果表明该毒株具有良好的免疫保护性，其效力可达到当前市售疫苗水平，符合药典标准。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1显示RV CTNCEC25株的传代历史。
[0015]图2显示RV CTNCEC25株接种原代鸡胚成纤维细胞后的细胞形态。
[0016]图3显示RV CTNCEC25株的特异性荧光。
[0017]图4显示RV CTNCEC25株全基因测序所用的引物。
【具体实施方式】
[0018]以下多次涉及CEC的制备、细胞突光灶转化单位实验(Fluorescence Focus UnitsAssay, FFU)和磷酸盐缓冲液(PBS)的制备，其具体操作分别如下所示:
[0019](I)原代鸡胚成纤维细胞(CEC)的制备
[0020]选用产出一周以内、形态正常、蛋壳厚薄均匀一致、无裂纹、蛋白浓稠的种蛋，放入38 土 1°C、相对湿度60 土 20%的孵蛋器内进行孵育，用检卵灯观察是否为受精卵及其活力。选用9~11日龄、鸡胚发育正常、可见清晰的血管及活动的鸡胚。用0.2% (m/v)的新洁尔灭溶液浸泡5分钟后捞出，气室向上置于蛋托上，然后用2%碘酊(m/v)和75%酒精(v/v)消毒后移入超净台内。用无菌镊子取出鸡胚，放入盛有IXHanks溶液的平皿内。去除鸡胚的头、内脏，放入灭 菌广口瓶内，用无菌剪剪切成I~3mm3的组织块，按照每枚鸡胚5~8ml的量加入预热至37°C的0.1% (m/v)胰酶溶液，置于37°C水浴箱内消化15~30分钟，加入50~300ml细胞生长液(以199培养基为基础，添加终浓度为5~10% (v/v)的牛血清，199培养基可购自北京清大天一科技有限公司，型号为M199MD505)，用无菌细胞吹打管吹打分散细胞得到细胞悬液，取1.0ml细胞悬液经10倍稀释后与等体积0.4% (m/v)台盼蓝混合均匀后，用血球计数板进行细胞计数，根据计数结果，将细胞密度调整为0.8~1.4X IO6个细胞/ml。
[0021](2)PBS (ρΗ7.4)的制备
[0022]称取8.0g氯化钠，0.2g氯化钾，0.27g磷酸氢二钾，1.42g磷酸二氢钠，加入800ml注射用水充分搅拌混匀，然后加入38%的浓盐酸调pH至7.4，最后定容至1000ml。经121 °C、15分钟灭菌后，室温保存备用。
[0023](3) FFU检测病毒滴度
[0024]①将待测病毒样品用PBS先进行10倍系列稀释，再进行3倍系列稀释。然后取
50μ I稀释后的病毒液接种50 μ I细胞密度为IXlO6个细胞/ml的BSR细胞(来源于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制研究所)。混合均匀后置于37°C，5%C02培养24小时。
[0025]②丙酮固定及染色
[0026]a.24小时后，倒弃上清液，用PBS洗涤一遍。
[0027]b.每孔加入50 μ 180% (v/v)冷丙酮，置于_20°C固定30分钟。
[0028]c.每孔加入50μ1 FITC标记的抗狂犬病病毒抗体(Millipore公司，Cat? N0.5100)，置于37°C孵育30分钟。
[0029]d.用PBS洗涤三遍，甩干，每孔加入50 μ 180% (v/v)甘油，直接置于荧光显微镜下观察每个稀释度的荧光灶数目。
[0030]e.取> 10个和< 10个荧光灶的相邻两孔稀释度的数据按照下列公式计算结果。待测样品滴度(lg FFU/ml)=lg{[(高稀释度的荧光平均数X3+低稀释度的荧光平均数)]/2X低稀释倍数X 1000/50}
[0031]表1
[0032]
【权利要求】
1.一种狂犬病病毒CTN鸡胚细胞适应株，其微生物保藏号为:CGMCC N0.6510。
2.权利要求1所述的狂犬病病毒CTN鸡胚细胞适应株在制备狂犬病病毒灭活疫苗中的用途。
【文档编号】C12R1/93GK103865889SQ201410132141
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月3日 优先权日:2014年4月3日
【发明者】王春华, 郭采平, 罗姗, 刘永娣, 李慧, 丁玉江, 容伟华, 周兰贞, 周维, 宋清爽, 黄伟荣, 田华, 朱士茂, 张信 申请人:深圳市卫光生物制品股份有限公司