一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，包括：用PCR方法获得目的基因，将GFAP启动子从pAAV-GFAP-hchR2-mcherry-WPRE载体上用合适的限制性内切酶切下，与目的基因连接克隆到pUC19载体上，然后通过合适的酶切位点将GFAP-EGFP-mir-505片段从pUC载体上切下，克隆到PB载体上，获得载体。本发明可与表达转座酶的辅助载体共注射小鼠的受精卵的雄性原核，得到转基因小鼠，用以研究miR-505在神经系统特别是在神经胶质细胞中的包括调控性发育启动在内的生物学功能，并且EGFP蛋白能方便地显示外源基因在神经系统中的定位。
【专利说明】一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于转基因小鼠领域，特别涉及一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法。
【背景技术】
[0002]MicroRNA是长度为21-25碱基单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。自从1993年第一个miRNA被报道以来，人们发现miRNAs几乎参与了所有重要的生物学过程的调控[Bartel DP(2004)MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.Cel1116(2):281-297], miRNAs的异常表达与人类多种疾病相关[Ambros V,朱万渠(2010):Micr0RNAs与疾病和发育生命科学3:27-29]。迄今为止，700多种已被鉴定出来的人源性miRNAs调控了人类1/3以上基因的表达。miR-505位于小鼠X染色体X:57647578-57647667处，ATPllC基因的第一和第二外显子之间的第一个内含子中，对于其生物学功能的研究目前还处于起步阶段。2010年，Verduci L等发现miR-505能通过作用于其靶标ASF/SF2 (可变剪接因子)发挥调控小鼠胚胎成纤维细胞的增殖和衰老/凋亡的作用[Verduci, L, Simili M, RizzoM, Mercatanti A, Evangelista M et al.(2010)MicroRNA(miRNA)-mediated Interactionbetween Leukemia/Lymphoma-related Factor(LRF)and Alternative splicing factor/splicing factor2(ASF/SF2)affects mouse embryonic fibroblast senescence andapoptosis.J Biol Chem, 285:39551-39563], ASF/SF2 也成为目前唯一经实验验证过的miR-505的靶蛋白。Karni R等发现在许多细胞中转染ASF/SF2可以激活mTOR部分信号通路[Karni R, Hippo Y, Lowe Sff, Krainer AR(2008) The splicing-factor oncoproteinSF2/ASFactivates mTORCl.Proc Natl Acad Sci USA105 (40): 15323-15327]，但是 ASF 参与调控mTOR的具体方式还不清楚。Yamamoto Y等在研究肿瘤多药抗性时,发现miR-505是一个新的肿瘤抑制miRNA，与其呈现负相关的蛋白Akt3，与mTOR通路上的AKT属于同一基因家方矣[Yamamoto Y, Yoshioka Y, Minoura K, Takahashi R, Takeshita F etal., (2011)An integrative genomic analysis revealed the relevance of microRNAand gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells.MolCancer, 10:13539551-39563]。因此我们有理由推测，miR-505可能参与调控mTOR信号通路，而具体的作用机制有待进一步研究和证实。mTOR信号通路被证明参与了大鼠的性发育启动调控，而小鼠性发育启动的调控中枢在下丘脑神经元，因此在神经元中特异性高表达miR-505对研究miR-505的生物学功能有重要的作用。
[0003]GFAP是胶质细胞酸性蛋白，其启动子能指导在转基因小鼠的神经胶质细胞中特异表达外源蛋白[Nolte C, Matyash M, Pivneva T, Schipke eg, Ohlemeyer C，HanischU, Kirchhoff F and Kettenmann H, (2001)GFAP promoter-controlled egfp expressingtransgenic mice:a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living braintissue.GLIA33:72 - 86]。因此在本研究中采用GFAP启动子来指导在神经元中特异性表达外源的miR505，同时导入EGFP基因来指示外源基因在小鼠中枢神经系统中的表达区域，将这些表达元件构建在PB表达载体上。
[0004]PB载体是piggybac转座子载体，PiggyBac转座子能够在生物体染色体中准确地切出和转座，适用范围较广，首先在在鳞翅目等昆虫中作为基因转移载体发挥作用，但现在已被证明也可在小鼠中发挥高效的转基因作用[Ding S，Wu X，Li G, Han M, Zhuang Y andXu T(2005)Efficient Transposition of the piggyBac Resource(PB)Transposon inMammalian Cells and Mice.Celll22:473 - 483]。转基因小鼠是研究基因功能的有效工具，传统的转基因小鼠一般通过利用质粒进行受精卵原核注射的方式来制备。通常会得到多个品系(Founders)。不同品系由于质粒在染色体上的整合位点不同、拷贝数不同，不同品系之间不容易得到一致的结果。由于转基因小鼠传代后拷贝数稀释以及基因沉默等原因，同一品系的表型在传代过程中也很容易丢失，造成实验结果不能重复。而PiggyBac转座子载体转座机制是遵循一剪切一粘贴Il (cut一and一paste)机制,能在小鼠染色体中进行准确的切出和转座，切出和插入时都需要转座酶的作用，并发生在特征性(TTAA)核苷酸序列目标位点M。本发明采用PB转座子载体进行外源基因的克隆，与另一表达PB转座酶的载体共注射小鼠受精卵的雄性原核中，实行外源基因(EGFP-miR-505)在小鼠基因组上的插入，通过鉴定子代小鼠基因组中外源基因的存在与否，得到在神经元中特异表达miR-505的转基因首建鼠。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，该方法可与表达转座酶的辅助载体共注射小鼠的受精卵的雄性原核，得到转基因小鼠，用以研究miR-505在神经系统特别是在神经胶质细胞中的包括调控性发育启动在内的生物学功能，并且EGFP蛋白能方便地显示外源基因在神经系统中的定位。
[0006]本发明的一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，包括:
[0007](I)以pcDNA6.2-EGFP_miR505为模板，进行PCR扩增，将PCR产物进行回收、用SphI 和 HindIII 双酶切、纯化回收，得到 EGFP-mir-505/SphI+HindIII 片段；
[0008](2) pUC-19用SmaI和BamHI进行双酶切，得到线性载体片段pUC19/BamHI SmaI ；pAAV-GPAP载体用MluI酶切后，以Klenow酶补平，然后以BamHI酶切，电泳分离酶切片段，回收GFAP启动子片段，与pUC19/BamHI SmaI连接，转化大肠杆菌感受态细胞，在含有氨苄青霉素的琼脂糖平板上筛选阳性克隆，得到PUC19-GFAP载体；
[0009](3)pUC19-GFAP 用 SphI 和 HindIII 双酶切后，与(I)中得到的 EGFP-mir-505/Sphl+HindHI片段进行连接，转化大肠杆菌，得到目的片段pUC19-GFAP-EGFP-mir-505 ；
[0010](4) PB[Act-RFP]DS载体用BamHI酶切，并用Klenow酶补平粘性末端后，以HindIII酶切，电泳分离回收得到PB载体片段；pUC19-GFAP-EGFP-mir_505以EcoRI酶切，并用Klenow酶补平粘性末端后，以HindIII酶切，电泳分离回收目的基因片段，与上述PB载体片段连接，得到中枢神经系统中特异表达miR-505的载体PB[GFAP-EGFP-mir-505]。[0011 ] 所述步骤(1)中PCR扩增所用引物为:
[0012]上游弓I 物 GCGCATGCCTAGAGAACCCACTGCTTAC ；
[0013]下游引物GCAAGCTTGCTATGGCAGGGCCTGCCG。[0014]所述步骤(1)中PCR反应体系为:GTbuffer 1.5 μ 1，2.5mM dNTPl.5 μ 1，上下游引物 1.5 μ 1，BSA0.2μ l，Taq0.2μ 1，原液 0.1 μ 1，H2OlO μ I ;PCR 反应条件为:93°C lmin30s ；93°C 30s, 57°C 30s, 65°C 2min，40 个循环；65°C IOmin0
[0015]所述步骤(1)中双酶切反应体系为:SphIly1，HindIIIly 1，10*M buffer5y I,PCR 产物 15 μ 1，Η2028 μ I。
[0016]所述步骤(2)中SmaI酶切反应体系为:SmaI2 μ 1，10*T buffer4y I,
0.1%BSA4 μ I，质粒 5 μ 1，Η2035 μ I ；BamHI 酶切反应体系为:BamHI2y 1，10*K buffer4 μ 1，质粒 7.7μ I, Η2036.3 μ I。
[0017]所述步骤(2)中MluI酶切反应体系为:Μ1ιιΙ2μ 1，10*Η buffer5 μ 1，质粒4 μ 1，Η2040 μ I ;补平产物 BamHI 酶切反应体系为:BamHI2 μ I，10*K buffer5 μ I，GFAP5 μ I，Η2038 μ I。
[0018]有益.效果
[0019]本发明采用PB转座子载体构建该表达载体，可与表达转座酶的辅助载体共注射小鼠的受精卵的雄性原核，得到转基因小鼠，用以研究miR-505在神经系统特别是在神经胶质细胞中的包括调控性发育启动在内的生物学功能，并且EGFP蛋白能方便地显示外源基因在神经系统中的定位，由于转座子插入的采用一剪切-黏贴Il方式，与传统的转基因小鼠相比，插入位点更易识别，拷贝数更易被检测，而且对染色体的损伤更小，因此遗传特性更加稳定。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1A-C为本发明载体的制备流程图；
[0021]图2 为 pcDNA6.2-EGFP_miR505PCR 扩增产物电泳图；
[0022]图3为pUC19双酶切电泳检测图；
[0023]图4为PAAV-GFAP MIuI单酶切电泳检测图；
[0024]图5为PGFAP启动子片段电泳检测图；
[0025]图6为pUC19-GFAP载体PCR检测结果；
[0026]图7 为 PB [GFAP-EGFP-mir-505]电泳检测图。
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0028]实施例1
[0029]I) EGFP-mir-505 基因的获得
[0030]以pcDNA6.2-EGFP_miR505为模板，以下列一对引物进行PCR扩±曾，得到EGFP-mir-505基因，长度为1400bp左右，序列如SEQ ID NO:1所示。
[0031]Pegfp-miR-505forward:
[0032] GCGCATGCCTAGAGAACCCACTGCTTAC[0033]Pegfp-miR-505reverse:
[0034]GCAAGCTTGCTATGGCAGGGCCTGCCG
[0035]体系:(15ul)
[0036]
【权利要求】
1.一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法,包括: (1)以pcDNA6.2-EGFP-miR505为模板，进行PCR扩增，将PCR产物进行回收、用SphI和HindIII 双酶切、纯化回收，得到 EGFP-mir-505/SphI+HindIII 片段； (2 ) pUC-19用SmaI和BamHI进行双酶切，得到线性载体片段pUC19/BamHI SmaI ；pAAV-GPAP载体用MluI酶切后，以Klenow酶补平，然后以BamHI酶切，电泳分离酶切片段，回收GFAP启动子片段，与pUC19/BamHI SmaI连接，转化大肠杆菌感受态细胞，在含有氨苄青霉素的琼脂糖平板上筛选阳性克隆，得到PUC19-GFAP载体； (3)pUC19-GFAP用 SphI 和 HindIII 双酶切后，与(I)中得到的 EGFP-mir-505/Sphl+HindHI片段进行连接，转化大肠杆菌，得到目的片段pUC19-GFAP-EGFP-mir-505 ； (4)PB[Act-RFP]DS载体用BamHI酶切，并用Klenow酶补平粘性末端后，以HindIII酶切，电泳分离回收得到PB载体片段；pUC19-GFAP-EGFP-mir-505以EcoRI酶切，并用Klenow酶补平粘性末端后，以HindIII酶切，电泳分离回收目的基因片段，与上述PB载体片段连接，得到中枢神经系统中特异表达miR-505的载体PB[GFAP-EGFP-mir-505]。
2.根据权利要求1所述的一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)中PCR扩增所用引物为: 上游引物 GCGCATGCCTAGAGAACCCACTGCTTAC ； 下游引物 GCAAGCTTGCTATGGCAGGGCCTGCCG。
3.根据权利要求1所述的一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)中PCR反应体系为=GTbufferl.5 μ 1,2.5mM dNTPl.5μ I,上下游引物 1.5 μ 1，BSA0.2μ 1，Taq0.2μ 1，原液 0.1 μ 1，H2OlO μ I ;PCR 反应条件为:93°C lmin30s ；93°C 30s, 57°C 30s, 65°C 2min，40 个循环；65°C IOmin0
4.根据权利要求1所述的一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)中双酶切反应体系为=SphIly 1，HindIIIly 1，10*Mbuffer5 μ I, PCR 产物 15 μ I，Η2028 μ I。
5.根据权利要求1所述的一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中SmaI酶切反应体系为:SmaI2 μ 1，10*T buffer4y I,0.1%BSA4 μ I，质粒 5 μ 1，Η2035 μ I ；BamHI 酶切反应体系为:BamHI2y 1，10*K buffer4 μ 1，质粒 7.7μ I, Η2036.3 μ I。
6.根据权利要求1所述的一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中MluI酶切反应体系为:MluI2y 1，10*H buffer5y 1，质粒4 μ 1，Η2040μ I ;补平产物BamHI 酶切反应体系为:BamHI2y 1，10*K buffer5 μ l,GFAP5y 1，H2038μ I。
【文档编号】C12N15/66GK103937826SQ201410136599
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】周宇荀, 仝莉, 李晓宁, 肖君华, 李凯 申请人:东华大学