一种岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTL1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种岷江百合抗病基因LrGSTL1及其应用，LrGSTL1基因核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，编码Lambda类谷胱甘肽S-转移酶，本发明通过功能基因组学相关技术证实岷江百合LrGSTL1基因具有提高植物抗真菌能力的功能，将本发明所述的岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTL1构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，转基因烟草具有很强的抗真菌活性，表达LrGSTL1的转基因烟草叶片对尖孢镰刀菌和灰葡萄孢两种病原真菌的侵染具有明显的抗性。
【专利说明】—种岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTLI及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有抗真菌活性的岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因Zr^7Z7及其应用，属于分子生物学以及基因工程相关技术研究领域。
技术背景
[0002]随着世界人口的不断增加，对粮食的需求日益增加，因此提高粮食产量是一个迫切需要解决的问题。农作物在生长发育过程中不断受到各种病原微生物的侵害，由真菌引起的病害占植物总病害的80%以上，并且已经严重影响到粮食的产量。此外，在各类病害中真菌病害的类型居多，而且真菌可以入侵植物的任何器官和组织并致其发病。防治植物病害的传统方法主要是使用化学农药和培育抗性品种，虽然两种方法均起到了一定成效，但是也都存在着严重的弊端。化学农药的大量使用造成环境的严重污染，给人畜健康带来不利影响；而常规育种又存在周期长、费时费力、植物资源的有利变异少等缺点，使得它们不能从根本上解决植物病害的难题。随着重组DNA技术的建立和发展，采用分子生物学的方法获得具有抗真菌活性的基因，并通过转基因技术在短期内培育具有抗病性的农作物，是提高植物抗病性的一种新方法。
[0003]病原体入侵植物时,植物主要通过防卫基因的表达、超敏反应(hypersensitivityresponse, HR)和系统获得性抗性(Sytemic acquired resistance, SAR)来抵御病原微生物的入侵。氧爆发是病原体感染植物早期的反应之一，随后产生超敏反应进行自身防御。氧爆发后，植物体内的活性氧(reactive oxygen species, R0S)类物质的生成量显著增加，如超氧根阴离子 (02_)、氢氧根离子(H0_)、羟基自由基(-OH)、过氧化氢等(H2O2)15这些活性氧能够损伤蛋白质、膜脂及其它细胞组分，并对植株造成氧化损伤。为了防止活性氧的损伤，植物通过谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GSTs)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)、谷胱甘妝过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)等来清除植物体内的自由基，从而缓解胁迫效应。
[0004]GSTs广泛存在于动物、植物、细菌和真菌中，组成具有多种生理功能的超基因家族。GST单体是分子量为22-27kDa的可溶性蛋白，主要以同源或者异源二聚体的形式存在。植物GSTs根据氨基酸序列的相似性、基因的组成以及活性位点的氨基酸残基分为ph1、tau、theta、zeta、lambda类和脱氢抗坏血酸还原酶6类。其中phi类和tau类是植物所特有的。谷胱甘肽通常在正常情况下以还原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)的形式存在，少量的以氧化型谷胱甘肽(GSSH)的形式存在。GSTs能催化GSH上的硫原子与第二底物亲电子部分共轭结合，产生易溶于水的复合物有利于它们排出体外，从而消除ROS等细胞内有毒物质的积累，维持了胞内氧化还原状态的平衡(Armstong R N, 1997.Structure,catalytic mechanism, and evolution of the glutathione transferases.ChemicalResearch in Toxicology, 10: 2-18 )。植物 GST 的研究起步较晚，1970 年在玉米(Zea
中首次发现植物 GST (Edwards R, Dixon D P, Walbot V.Plant glutathioneS-transferases: enzymes with multiple functions in sickness and in health.Trends in Plant Science, 2000: 193-198),此后在烟草(AYcoiiaaa iaAaca?)、拟南芥(Arab i clops is thaliana ) > (Tri ti cum ae s t i vum)、马铃毫 QSo I anum tuberosum)等作物中相继发现具有功能活性的GSTs。由于GSTs参与植物应对生物胁迫和非生物胁迫的防御反应，GSTs的基因克隆和应用在农业生产上具有重要的价值，并日益受到人们的重视。
[0005]GSTs在植物抵抗真菌胁迫中起重要作用。用晚疫病菌从ora infestans)接种马铃薯后，/tt/77-7编码的GST蛋白表达量显著增加，并且该蛋白与吲哚-3-乙酸反应，表明11引哚-3-乙酸可作为GST的调控子或底物参与抗病反应(Hahn K, StrittmatterG.Pathogen-defense gene prpl—1 from potato encodes an auxin responsiveglutathione S-transferase.Eur J Biochem.1994, 226: 619-626)。玉米接种印度梨形孢iPiri formosporaindi ca ) IO天后，与对照组相比植株根部过氧化氢酶(CAT )、GST以及超氧化物歧化酶(SOD)活性分别提高了 44倍、92倍和48倍，从而增强植株抗氧化能力，进而提高了玉米的抗病性(Kumar M , Yadav V, Tuteja N, Johri AK.Antioxidant enzyme activities in maize plants colonized with Piriformosporaindica.Microbiology.2009, 155: 780-790)。用植物激素、除草剂、氧化胁迫和霜霉病菌QPeronospora parasitica)处理拟南芥，IM1 AtGSTFl6在这些处理下均上调表达，表明J tGSTFW在拟南芥抗生物胁迫和非生物胁迫中都有一定作用(Wagner U, EdwardsR, Dixon DP, Mauch F.Probing the diversity of the Arabidopsis glutathioneS-transferase gene family.Plant Mol Biol.2002, 49: 515-532)。从感染炭疽病菌(Colletotrichum destructivum')的烟草cDNA文库中克隆了 4个GST基因，烟草接种炭疽病菌后，姑仏爪7 MNbGSTU3的表达增加，将这4个基因构建到诱导基因沉默的PVP病毒载体上，发现沉默的烟草植株对病菌的敏感性显著增加，表明基因在烟草抗COfe1SirwciiK應感染 中起着重要的作用(Dean JD, Goodwin PH, Hsiang T.1nduction ofglutathione S-transferase genes of Nicotiana benthamiana following infectionby Colle to tri chum des true ti vum and C.0rbi culare and involvement of one inresistance.Journal of Experimental Botany.2005, 56: 1525-1533)。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是从眠江百合(Zi7iw?Wilson)中克隆获得具有抗真菌活性的lambda类谷胱甘肽硫转移酶基因ZrM7Z7，ZraTZ7的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所不，该基因的cDNA全长序列为1076bp,包含了一个717bp的开放阅读框(open readingframe, 0RF)、22bp的5’非翻译区和337bp的3’非翻译区，编码含有238个氨基酸的蛋白质，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]本发明中岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTLl的编码区是序列表SEQ IDNO:1中第23-739位所示的核苷酸序列。
[0008]本发明的ZrM7Z7基因来自岷江百合。岷江百合又名王百合，为百合科百合属多年生草本球根植物，是我国特有的野生百合，分布于四川岷江流域。岷江百合对真菌、病毒及干旱胁迫具有极强的抗性，是珍稀的百合抗病育种遗传资源。
[0009]本发明分离并克隆了岷江百合中携带的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，利用根瘤农杆菌介导将目的基因转入受体植物中并过量表达，进而通过实验验证该基因是否具有抗真菌活性，为后期利用该基因改良烟草以及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础。发明人将这个基因命名为LrGSTLl。
[0010]植物受病原真菌胁迫时，植物体内的活性氧爆发，GSTs催化GSH与亲电化合物结合，产生易溶于水的复合物从而有利于亲电化合物排出体外，从而降低ROS等细胞内有毒物质的水平，维持了胞内氧化还原状态的平衡。此外GSTs还具有谷胱甘肽过氧化物酶活性，因而在植物抗病反应中起重要的作用。
[0011]本发明涉及分离Zr^7Z7的全长cDNA片段并鉴定其功能，具有该基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌侵染的表型。其中所述DNA片段如序列表SEQ ID NO:1所示。对该基因进行序列分析，W^UrGSTll全长cDNA为1076bp，具有717bp的开放阅读框、22bp 的 5，非翻译区(untranslated region, UTR)和 337bp 的 3，UTR，编码含有 238个氨基酸的蛋白质。编码蛋白具有GSTs家族的保守结构域，与来自香蕉(Musaacuminata)、玉米和水稻等植物的GSTs蛋白同源性较高，同时聚类分析将归于植物lambda类GSTs (GSTL)，上述分析结果表明LrGSTLl属于岷江百合中的lambda类GST基因。超量表达序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列蛋白质可以增强烟草对灰葡萄孢{Bo try Hs ciflerea )、尖孢镰刀菌(/7W1Sari--两种病原真菌的抗性。[0012]本发明的另一个目的是将岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因Zr^7Z7应用在提高烟草对尖孢镰刀菌、灰葡萄孢抗性中，具体操作如下:
(I)基因的获得:采用扩增ZrM7Z7的特异引物，从接种尖孢镰刀菌后的岷江百合根中提取总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chainreaction, RT-PCR)扩增出ZrM7Z7的全长编码区，然后将其连接到pMD_18T载体上，经测序验证获得具有目的基因的克隆。
[0013](2)植物表达载体构建与遗传转化:用限制性内切酶I和I酶切m-l^-LrGSTLl质粒，通过胶回收获得目的基因片段，用同样的内切酶消化酶切植物表达载体PCAMBIA2300S，胶回收获取所需载体大片段；随后将目的基因片段与pCAMBIA2300S载体大片段连接，构建植物超表达载体pCAMBIA2300s-Zr^7Z7 ;通过液氮冻融法将pCAMBIA2300S-Zr^7Z7质粒导入农杆菌菌株LBA4404中；利用根瘤农杆菌介导的遗传转化職LrGSTLl导入烟草中表达；通过抗生素筛选、基因组DNA PCR和RT-PCR筛选阳性转基因植株。
[0014](3)转基因植株抗真菌活性分析:取转基因植株和野生型植株(非转基因对照)叶片，分别接种不同真菌的孢子悬液，检测接种后转基因叶片的发病情况，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。
[0015]本发明为增强植物对真菌病害的抗性提供了一种新方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以弥补传统育种的不足，不仅育种周期短、操作简单，而且容易获得高抗性植株。将来自岷江百合的Zr^7Z7基因导入烟草中表达，能产生具有抗真菌特性的新材料和新品种，并且转基因烟草具有很强的抗真菌活性。摄輪LrGSTLl的转基因烟草对尖孢镰刀菌、灰葡萄孢的侵染均具有明显的抗性。利用基因工程技术培育具有抗性的植物品种从而防治植物病害的方法具有显著的优势和不可替代的重要性。它可以为作物、花卉等大规模生产提供方便，并且大量减少了化学农药的使用，减小环境污染，还可以为农业生产节约成本，因此本发明具有广阔的市场应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是本发明中部分ZrM7Z7转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果，其中Marker:DL2000 DNA Marker (大连宝生物)，由 2，OOObpU, 000bp、750bp、500bp、250bp 以及IOObp六条DNA片段组成，正对照:以质粒pMD-18T-ZrM7Z7为模板的PCR产物；WT:以非转基因烟草(野生型)总DNA为模板的PCR产物；
图2是本发明中阳性Zr^7Z7转基因烟草中Zr^7Z7转录水平的表达分析结果，其中Marker:DL2000 DNA Marker (大连宝生物);WT:非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；正对照:质粒pMD-18T-ZrM7Z7为模板的PCR产物；其余泳道为不同的阳性LrGSTLl转基因烟草单株；
图3是本发明中LrGSTLl转基因烟草叶片及WT叶片接种真菌后的抗性分析结果，其中图a、b中接种的真菌分别是灰葡萄孢和尖孢镰刀菌；L-1、L-5、L-8、L-10、L-13是5个不同饱LrGSTLl转基因烟草单株，WT是非转基因烟草单株。
【具体实施方式】
[0017]下面通过实施例对本 发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
[0018]实施例1 'LrGSTLl全长基因的克隆以及序列分析
用尖孢镰刀菌接种岷江百合，用接种24 h后的根提取总RNA。用液氮将处理过的岷江百合的根研磨成粉末以后，转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA，采用逆转录酶M-MLV (promega)以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为:取5 UgTotal RNA，依次加入 50 ng oligo(dT) 15、2 μ L dNTP (2.5mM each)、DEPC 水至反应体积为13.5 μ L ;混匀后，70°C加热变性5min后迅速在冰上冷却5min，然后依次加入4 μ L5XFirst-stand buffer,0.5 μ L RNasin (200U)、1 μ L M-MLV (200U)，混匀并短时离心，42°C温浴1.5 h，取出后70°C加热lOmin，终止反应，cDNA第一链合成后置于_20°C保存备用。
[0019]以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因ZrM7Z7，所用上下游引物序列为5，CAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3’ 以及 5，CACCACCTGTGAGACGATGAAGA3，。采用 Advantage?
2PCR Enzyme (Clontech)扩增出目的基因。PCR 反应条件:94°C 2 min ；94°C 30 s，62°C30 s，72°C lmin，30 cycles ；72°C 5 min。反应体系(20 μ L)为 I μ L 第一链 cDNA、2 μ LlOXBuffer.0.5 μ L dNTP (IOmM each) ,0.3 μ L 正向引物(10 μΜ)、0.3 μ L 反向引物(10 μΜ)、0.25 μ L Advantage? 2 PCR Enzyme、15.65 μ L PCR-Grade Water。PCR 结束后，取5 UL用于琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物的特异性以及大小。
[0020]凝胶电泳显示PCR产物为单一的特异条带，因此直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为PMD18-T vector kit (大连宝生物)，反应体系和操作过程为:取1.5 μ LPCR产物，依次加入 I μ L pMD-18T vector (50ng/ μ L)和 2.5 μ L 2 X Ligation solutionI，混匀置于16°C过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5a中。用含有X-Gal, IPTG、氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个白色菌落，摇菌后用扩增心€517的特异引物鉴定出多克隆位点插入Zr^7Z7的克隆。将鉴定的克隆进行测序，最终获得的全长cDNA为1076bp，通过NCBI ORF finder(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析发现其包含一个 7Hbp 的 ORF (见序列表)。LrGSTLl编码一个含238个氨基酸的蛋白质，LrGSTLl的分子量约为27.28 KDa,等电点为5.21。SignalP 3.0分析结果显示ZrM7Z7没有信号肽的存在，而且蛋白质定位预测结果显示LrGSTLl可能定位于叶绿体中。
[0021]实施例2:植物表达载体构建
采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取插入ZrM7Z7的大肠杆菌质粒pMD-18T-ZrM7Z7以及植物表达载体pCAMBIA2300S的质粒，取I μ L用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性和浓度。用&oRI (TaKaRa)和I (TaKaRa)分别对质粒pMD-18T-ZrM7Z7和pCAMBIA2300S进行双酶切(100 μ L体系)，反应体系和操作过程为:取 20 μ L pMD-18T-ZrM7Z7 或 pCAMBIA2300S 质粒、依次加入 10 μ L IOXH buffer,5μ l￡coRl,h μ L 60 μ L ddH20，混匀后短时离心，置于37°C过夜反应。将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对片段和pCAMBIA2300S大片段分别进行胶回收，整个过程使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)。取I μ L回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度。
[0022]利用Τ4 DNA Ligase (TaKaRa)，将回收的 LrGSTLimk 片段和 pCAMBIA2300S 载体片段连接起来，反应体系(20 μ L)和操作过程为:取10 UL LrGSTLl基因片段依次加入2μ L pCAMBIA2300S 载体 DNA、2 μ L 10ΧΤ4 DNA Ligase BufferU μ L Τ4 DNA Ligase、5μ L ddH20，混匀后短时离心，置于16°C金属浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH 5a中，用含有50mg/L卡那霉素(kanamycin, Km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增Zr^7Z7的特异引物进行PCR，挑选出Zr^7Z7与pCAMBIA2300S成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入20%甘油混匀后置于_80°C保存备用。
[0023]用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒(上海生工)提取并纯化上述大肠杆菌中的pCAMBIA2300S-Zr^7Z7质粒。制备农杆菌LBA4404菌株的感受态细胞并分装于1.5 mL离心管中，每管200 μ L，液氮速冻后置于-80°C保存备用。采用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300S-ZrM7Z7转入农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为:取200ng pCAMBIA2300S-ZrM7Z7质粒加入含有200 μ L感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5 min,接着转入液氮中冷冻I min,然后迅速置于37°C水浴5 min,之后立即冰浴2 min,加Λ 800 μ L LB液体培养基，28°C振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28°C静止培养。挑选单克隆摇菌，用扩增ZrM7Z7的特异引物进行PCR，检测pCAMBIA2300S-ZrM7Z7是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入甘油后置于_80°C保存备用。
[0024]实施例3:农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选
本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75%的酒精浸泡30 S，用无菌水洗涤后用
0.1%的HgCl2表面消毒8 min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 MS培养基上，28°C暗培养5-8 d，发芽后转至光照培养箱(25°C，16h/d光照)，以后每月用1/2MS培养基继代一次。
[0025]从_80°C冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-ZrM7Z7质粒的农杆菌LBA4404菌种，接种于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液体培养基中，28°C培养至浑浊。吸取I mL浑浊的菌液至含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28°C培养48 h。将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于含20 mg/L乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28°C振荡培养2-3 h以活化农杆菌。
[0026]取烟草无菌苗嫩叶切成I cm2左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，浸染15 min。用无菌滤纸吸干叶盘表面的菌液，将叶盘排列在烟草转化共培养基上并于22°C暗培养2天。共培养基为MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂。
[0027]将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。筛选培养基为 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L 琼脂+50 mg/L Km+200 mg/L头抱霉素(cefotaxime sodium salt,Cef);筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱(25°C，16 h/d光照，8 h/d黑暗)。叶盘出芽后用含有50 mg/L Km和200 mg/LCef的MS培养基继代培养，因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选，将烟草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培养基上使其生根，最后选择生根较好的再生苗进行下面的检测。
[0028]采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，取I μ L基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度。以转基因植株的基因组DNA为模板用扩增Zr^7Z7的特异引物进行PCR JCR结束后，取8 μ L产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株。部分转基因烟草植株的 扩增结果如图1积示,LrGSTLl转化烟草共筛选到62株阳性转基因植株。
[0029]实施例4:转基因烟草中LrGSTLl的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析
随机挑选30株阳性转基因单株和一株非转基因烟草(野生型，WT)，分别取嫩叶并提取总RNA，逆转录生成第一链cDNA，并以此为模板用扩增ZrM7Z7的特异引物进行PCR，根据RT-PCR结果分析各转基因单株中LrGSTLl转录水平的表达。总RNA提取及RT-PCR的方法和步骤与实施例1中相同，PCR结束后，取8 μ L用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示。共检测到16株转基因单株中Zr^7Z7在转录水平有表达，这些植株分别编号为I~16。
[0030]将实验室保存的几种病原真菌接种于PDA固体培养基(200g/L马铃薯，15g/L琼脂，20g/L葡萄糖)上，28°C倒置暗培养6天，用无菌水将分生孢子从培养基上洗脱下来，血球计数板计数后将分生孢子悬液稀释成IO6个孢子.mL—1的浓度，用于接种烟草叶片以分析转基因植株的抗真菌活性。供试真菌共有7种:葡萄座腔菌iffotrosphaeriat/oiAiofea),尖孢镰刀菌(Fusarium,拟莖点霉属(Phomopsis sp.)真菌，链格抱属(Alterrmria sp.)真菌，灰葡萄抱(Botrytis ciflerea),胶抱炭疽菌{ColIetorichum
,串珠状赤霉菌{Gibberella moniliformis)。取不同转基因株系以及WT的幼嫩叶片，受伤处理后接种孢子悬液20 μ L，将接种后的烟草叶片平铺在湿滤纸上，置于28°C培养箱中3-5天，之后观察真菌接种后烟草叶片的发病程度，并据此评价转基因烟草的抗真菌活性。结果如图3积示,LrGSTLl转基因烟草对灰葡萄孢菌、尖孢镰刀菌的侵染具 有明显的抑制作用。
【权利要求】
1.一种岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因ZrM7Z7，其特征在于:其核苷酸序列如SEQID NO:1所不,编码如SEQ ID NO:2所不氣基酸序列的蛋白质。
2.权利要求1所述岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTLl在提高烟草对尖孢镰刀菌、灰葡萄孢抗性中的应用。
3.根据权利要求2所述的岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因Zr^7Z7的应用，其特征在于提高烟草的抗真菌能力的具体操作如下: (1)将上述谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTLl与植物超表达载体pCAMBIA2300S连接，构建植物超表达载体； (2)将上述构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中； ( 3)通过卡那霉素筛选转化子，并采用扩增Zr^7Z7的特异引物进行聚合酶链式反应获得真正的转基因植株，取不同转基因株系的叶片接种真菌，并检测转基因烟草叶片的发病程度，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。
【文档编号】C12N15/54GK103937819SQ201410137601
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月8日 优先权日:2014年4月8日
【发明者】刘迪秋, 何华, 韩青, 季博, 张南南, 葛锋, 陈朝银 申请人:昆明理工大学