一种基于bcfD基因的沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于bcfD基因的沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法。该试剂盒包括（1）10×Lamp?buffer；（2）8000U/mL?BstDNA聚合酶；（3）10mM?dNTPs；（4）Lamp引物组：外引物5pmol/μL，内引物40pmol/μL，环引物20pmol/μL；（5）双蒸水；（6）荧光染料：10×SYBR?GreenI；（7）阳性对照：沙门氏菌标准株基因组DNA；（8）阴性对照：双蒸水。本发明的LAMP检测方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、广谱性、适合现场检测等优点，不需要复杂仪器，为沙门氏菌的检测提供了新的技术支撑，可用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位、出入境和各疾病预防控制中心筛查和检测沙门氏菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
【专利说明】—种基于bcfD基因的沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学检测【技术领域】，尤其涉及的是一种基于bcfD基因的沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
【背景技术】
[0002]沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中最常见的人畜共患病原菌，常寄生于动物和人体肠道内。不论发达国家还是发展中国家，沙门氏菌都是导致人类感染的重要食源性细菌。由沙门氏菌引起的食物中毒是所有细菌性食物中毒中比例最高，危害最广的一种，约占细菌性食物中毒的42.6%-60%。目前，国内对于沙门氏菌的检测仍以常规细菌学检测方法为主，其不足之处主要表现在:第一、操作步骤烦琐耗时，现行的国家标准或行业标准中对沙门氏菌的检测通常需要4-6天，已不能满足及时有效的质量监测和疾病防控需求；第二、灵敏度较低，当样品中沙门氏菌含量较低时，易造成假阴性结果；第三、准确度不高，尤其是加工后的食品受加热、干燥、高盐和冷冻等因素的作用，其中的沙门氏菌可形成营养缺陷型，导致表型不典型，用传统方法检测容易出现假阴性结果，造成检测结果的差异。因此，如何提高沙门氏菌检出率，缩短检测时间，防止因样品复杂性、抑制因子多等原因等抑制反应而发生漏检的现象发生，对保证食品安全具有重要的意义。
[0003]随着分子生物学的不断发展，传统的细菌学检测方法已不能满足沙门氏菌的快速批量诊断，对病原微生物的鉴定不再局限于形态学等检验上，已发展到从分子水平上检测病原核酸和蛋白质等生物大分子，新的诊断技术不断出现，如免疫荧光、酶联免疫、放射免疫、PCR、斑点杂交、基因芯片等，其中许多方法可以在24h内检出沙门氏菌，但需要配备专用设备，操作复杂，且常有非特异性结果出现，仍不能满足快速检测的要求。
[0004]环介导等温扩增技术是一种近年来发展起来的新型核酸快速检测方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换型DNA聚合酶，能在等温条件下(60~65°C)、Ih内特异地扩增出1O9~101°拷贝靶序列。在保持传统PCR技术优点的基础上，进一步提高了反应的特异性，同时缩短了检测时间。现已被应用于多种病原微生物的检测和研究，并具有良好的发展前景。
[0005]菌毛是沙门氏菌在宿主黏附定植的关键因子，在诊断试剂研发领域具有极其重要的意义。沙门氏菌可以表达多种菌毛，不同菌毛由相应的菌毛操纵子基因编码表达。研究表明，bcf菌毛操纵子是目前发现在沙门氏菌中最为保守的一种菌毛操纵子，在肠道沙门氏菌与邦戈尔沙门氏菌所包含的血清型中均保守存在；而研究较多的fim菌毛操纵子则主要存在于肠道沙门氏菌，而在邦 戈尔沙门氏菌中并不存在。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在检测沙门氏菌中存在的问题，提供了一种基于bcfD基因的沙门氏菌分子检测试剂盒及其非诊断性检测方法。[0007]本发明的技术方案如下:
[0008]一种基于bcfD基因的沙门氏菌分子检测试剂盒，包括:
[0009](1)IOXLamp buffer ；
[0010](2) 8000U/mL BstDNA 聚合酶；
[0011](3) IOmM dNTPs ；
[0012](4) Lamp引物组:外引物浓度为5pmol/ μ L，外引物为F3和Β3，F3序列为5’ -CCGGACAAACGATTCTGGTA-3’，B3 序列为 5’ -CCGACATCGGCATTATCCG-3’ ；内引物浓度为40pmol/y L,内引物为 FIP 和 BIP，FIP 序列为 5’ -TGCACTTTACCGGTACGCTGAATACAGCGGCAATTTCAACCA-3’，BIP 序列为 5’ -CGGTCTGGATTCGCAGGTCAAAGCGATAGCCTGGGGAAC-3’ ；环引物浓度为 20pmol/y L，环引物为 LF 和 LB，LF 序列为 5’ -TACCCCCTCCGGCTTTTG-3’，LB 序列为5’ -ACAATGCGTCTTATCGCTACG-3’ ；
[0013](5)双蒸水；
[0014](6)荧光染料:10XSYBR Green I ；
[0015](7)阳性对照:沙门氏菌标准株基因组DNA ；
[0016](8)阴性对照:双蒸水。
[0017]所述的IOXLamp buffer 含有 200mM Tris-HCl (ρΗ8.8，25 °C )、IOOmM 氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁、8M甜菜碱和体积百分浓度为1%的曲拉通X-100。
[0018]基于bcfD基因的沙门氏菌分子检测试剂盒的非诊断性检测方法，包括如下步骤:
[0019](I)待检样品基因组DNA的提取:按常规方法提取或试剂盒提取；
[0020](2) LAMP检测反应体系如下表所示:
【权利要求】
1.一种基于bcfD基因的沙门氏菌分子检测试剂盒，其特征是，包括:
(1)10XLampbuffer ； (2)8000U/mL BstDNA 聚合酶；
(3)1OmM dNTPs ； (4)Lamp引物组:外引物浓度为δρπιο?/μ L，外引物为F3和Β3，F3序列为5’ -CCGGACAAACGATTCTGGTA-3’，Β3 序列为 5’ -CCGACATCGGCATTATCCG-3’ ；内引物浓度为40pmol/y L,内引物为 FIP 和 BIP，FIP 序列为 5’ -TGCACTTTACCGGTACGCTGAATACAGCGGCAATTTCAACCA-3’，BIP 序列为 5’ -CGGTCTGGATTCGCAGGTCAAAGCGATAGCCTGGGGAAC-3’ ；环引物浓度为 20pmol/y L，环引物为 LF 和 LB, LF 序列为 5’ -TACCCCCTCCGGCTTTTG-3’，LB 序列为5’ -ACAATGCGTCTTATCGCTACG-3’ ； (5)双蒸水； (6)荧光染料:10XSYBRGreen I ； (7)阳性对照:沙门氏菌标准株基因组DNA； (8)阴性对照:双蒸水。
2.根据权利要求1所述的基于bcfD基因的沙门氏菌分子检测试剂盒，其特征是，所述10 X Lamp buffer 含有 200mM Tris-HCl、IOOmM 氯化钾、IOOmM 硫酸铵、20mM 硫酸镁、8M 甜菜碱和体积百分浓度为1%的曲拉通X-100。
3.根据权利要求1所述的基于bcfD基因的沙门氏菌分子检测试剂盒的非诊断性检测方法，其特征是，其步骤如下: (1)待检样品基因组DNA的提取:按常规方法提取或试剂盒提取； (2)LAMP检测反应体系如下表所示:
【文档编号】C12Q1/68GK103898222SQ201410137471
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】龚建森, 许明, 贾雪波, 庄林林, 王成明, 朱春红, 刘学贤, 徐步, 窦新红, 童海兵, 邹剑敏 申请人:江苏省家禽科学研究所