一种沙门氏菌crispr分型方法
【专利摘要】本发明提供了一种沙门氏菌的CRISPR分型方法，通过对沙门氏菌的CRISPR1位点和CRISPR2位点之间最新间隔序列的DNA测序，以确定待检测菌株的CRISPR型别，进而可以进行血清型别的预测。所述方法简单，快速，费用低，分辨率高，与沙门氏菌血清分型结果一致性高，对实验室设备及软件要求低，且新的CRISPR型别包含有细菌进化及地域等诸多信息，并可联合荧光探针等方法实现实时快速检测，具有推广应用价值。
【专利说明】—种沙门氏菌CRISPR分型方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种沙门氏菌分子分型方法，属于分子流行病学领域。
【背景技术】
[0002]沙门氏菌是一类危害人和动物健康的重要致病菌，其菌属型别繁多，抗原复杂，因此对沙门氏菌的防治造成了极大的困难。沙门氏菌的分子分型能对其进行准确的诊断和溯源，在分子流行病学方面，这种便捷高效且高分辨率的分型方法对大规模的流行病检测和沙门氏菌的进化具有极其重要的意义；在临床治疗方面，由于沙门氏菌会在耐药和毒力方面具有型别特异性，因此对其准确的分型能在很大程度上对病情的发生发展和转归有一个提前的预见作用，且在临床治疗和用药上也能提供一个可靠的依据。
[0003]此外，对于沙门氏菌的爆发监测是疾病预防控制机构的重要任务之一，但目前的疾病控制机构存在数量不足及高端分型设备不足等诸多问题。这种新型的分型方法由于原理简单、操作容易、成本低廉且对实验室的设备及技术人员的要求不高，因此能在更广泛的范围内进行疾病的监测和预警，对我国的疾控事业将会起到一个有利的促进作用。
[0004]沙门氏菌菌属型别繁多，抗原复杂，目前已明确的血清型达2500多种，是引起食源性腹湾的重要病原菌之一；多为点序列分型(Multilocus Sequencing Typing,MLST)技术分辨率高、重复性好，但有时不稳定；脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field GelElectrophoresis, PFGE)是细菌分型的金标准，其技术分辨率高，但比较费时，且对仪器设备要求高，在图像处理时主观造成的偏差较难克服。
[0005]成族的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularlay interspaced shortpalindromic repeats, CRISPR)是近年来发现的细菌针对卩遼菌体等外源DNA的获得性免疫系统。CRISPR系统主要由CRISPR簇，前导序列(leader)和CRISPR相关蛋白基因(CRISPR-associated，cas)基因共同组成。CRISPR簇又由一段不连续的同向重复序列(direct repeat, DR)和插入其中的间隔序列(spacer)组成。DR序列在一个CRISPR簇中的大小和序列几乎相同，其在沙门氏菌中的长度基本为29bp。不同CRISPR系统中间隔序列(spacer)的长度为17_84bp，而沙门氏菌中基本为32bp。研究表明，CRISPR的作用原理为:在噬菌体入侵宿主细胞后，CRISPR系统会从外来的噬菌体序列中选取一段序列加工成新的重复序列与间隔序列(repeat-spacer, R-S序列)后重组到CRISPR族内，使得宿主获得抵抗相应噬菌体再次入侵的能力。这使得CRISPR系统具有了极其丰富的序列多态性。重要的是，这种CRISPR系统能作为一种记录细菌与噬菌体相互斗争的编年史被稳定的遗传下来，这不仅能在细菌的分子分型上开辟一个新的领域，还能为我们更好的研究细菌的进化和迁徙史提供一条重要 的线索。
[0006]目前国内外已有利用CRISPR进行细菌分型的相关研究，但由于现存的CRISPR分型方法依据的是对全部CRISPR位点中所有的间隔序列(spacer)进行测序分析后实现的，虽说分辨率极高，但这种分型方法费时费力且建立相关数据库需要的信息量巨大。
[0007]研究发现，间隔序列在细菌进化过程中存在插入和选择剔除的现象，使得CRISPR结构具有多态性，并且在同一物种的不同菌株间存在一定的差异。因此，CRISPR结构可以作为细菌分型溯源与进化研究的理想位点。目前关于沙门氏菌的CRISPR分型方法国外有4篇有文献报道(1.Liu, et al.Appl Environ Microbiol77:4520-4526 ;2.Liu, F et al.ApplEnviron Microbiol77:1946-1956.3.Fabre, et al.PLoS 0ne7:e36995.4.Shariat, N.，etal..BMC Microbiol 13:254.)，但由于其分析对象为沙门氏菌两个CRISPR位点的全部间隔序列(spacer)，甚至有些为了提高其分辨率，联合两个沙门氏菌毒力基因sseL和fimH，建立了 CRISPR-MLVA的多位点分型系统。但以上关于沙门氏菌的CRISPR分型方法仍具有诸多不足，比如分析的spacer数量繁多，且每个CRISPR结构的spacer数量不等,这都不便于实验室快速的分子分型，具有耗时，不经济等缺点。
[0008]沙门氏菌病是感染性腹泻的主要病原菌之一。世界卫生组织证实沙门氏菌病是当前重新出现的最重要的传染性疾病之一。近年来，病原微生物的分子分型技术发展较快，如限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA (RAPD-PCR)、重复性核酸扩增(Rep-PCR)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分析(MLST)、多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)等，其中一些成熟的高通量且便于推广应用的分子分型技术，如PFGE、MLST, MLVA已经应用于传染病爆发流行监测，并在传染源的追溯、传播链的确认、新的流行菌株的发现、遗传变异、系统发生分析甚至于疫情的预警预报等方面发挥了重要作用。以上各种分型方法都有利有弊，RFLP方法重复性好、操作简便，但分辨率有限；AFLP方法分辨率高、重复性好，但技术难度也很高；RAPD-PCR和Rep-PCR分辨率高，但重复性差；PFGE技术分辨率高、重复性好，被誉为病原微生物分子分型的“金标准”，但其对专业设 备和软件要求高，不适合基层疾控单位和设施较简单的实验室开展，而且通过分析电泳图像带有一定的主观性，加之不可避免的手动调图也使得该方法不能很好地进行高通量分析诠释及数据交换。
【发明内容】
[0009]本发明旨在建立一种十分简便的沙门氏菌的CRISPR分型方法。所述方法包括以下步骤:
[0010](I)提取待检测菌株培养物的DNA ；
[0011](2)分别取适量的步骤(1)DNA提取物，进行CRISPR1位点和CRISPR2位点的PCR扩增，其中CRISPR1位点扩增的上游引物为SEQ ID NO:1，下游引物选自SEQ ID NO:2-7中的一种；CRISPR2位点扩增的上游引物为SEQ ID NO:8，下游引物选自SEQ ID NO:9或SEQID NO:10 ；
[0012](3)分别对步骤⑵所述CRISPRl位点的扩增产物和所述CRISPR2位点的扩增产物的扩增产物进行DNA测序；
[0013](4)确定CRISPR1位点序列和CRISPR2位点序列中的最新间隔序列，根据二者的间隔序列组合确定所述沙门氏菌的CRISPR型别。
[0014]在本发明的一个优选技术方案中，步骤(2)所述的CRISPR1位点扩增用的下游引物为 SEQ ID NO:2o
[0015]在本发明的另一个优选技术方案中，步骤(2)所述的CRISPR2位点扩增用的下游引物为 SEQ ID NO:9。[0016]在本发明的一个优选技术方案中，步骤(3)所述的DNA测序为反向引物测序，所用引物为步骤⑵所述PCR扩增的下游引物。
[0017]在本发明的一个优选技术方案中，步骤⑷所述的最新间隔序列分别为CRISPR1位点和CRISPR2位点的最后两个重复序列之间的序列。
[0018]如图1所示，所述最新间隔序列(new spacer)为CRISPR位点最靠近前导序列(leader)的间隔序列，可运用CRISPRdb网站中的CRISPRfinder功能进行CRISPR结构的整理(http: //crispr.u~psud.fr/crispr/),也可直接通过序列分析软件DNAstar将最靠近下游引物的一个间隔序列直接找出。
[0019]优选地，所述的最后两个重复序列由SEQ ID NO:11所示。，通常CRISPR的第一个重复序列为SEQ ID NO: 12所示，其余重复序列为SEQ ID NO:11所示，而最后两个重复序列之间的间隔序列即为最新的间隔序列(有关重复序列的类型可见巴斯德数据库http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/crispr/CRISPRDB.html)。
[0020]可将找出的CRISPRl位点和CRISPR2位点中的最新间隔序列在间隔序列代码表(来自巴斯德数据库 http: / / www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/crispr/CRISPRDB.html)中转化为spacer代码。随后将两个间隔序列代码按照CRISPR1在前，CRISPR2在后的顺序组成一个间隔序列组合，并以此代表改型沙门菌的CRISPR型别。
[0021]本发明方法还可以包括步骤(5)，即，通过待检测菌株的CRISPR型别确定所述菌株的血清型(CRISPR型别-血清型预测表可见表1)，实现对其血清型的预测。
[0022]本发明方法省时，经济，分辨率高，易于操作，且与沙门氏菌血清分型一致度高，对实验室设备及软件要求低，可联合荧光探针等实现实时快速的检测，且能通过最新间隔序列的报告探针实现现场快速检测等优点。在分辨率方面较依靠七个管家基因的多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)略高,但花费却仅有传统MLST的四分之一(仅需两个短序列的测序)。
[0023]对于沙门氏菌的爆发监测是疾病预防控制机构的重要任务之一，但目前的疾病控制机构存在数量不足及高端分型设备不足等诸多问题。这种新型的分型方法由于原理简单、操作容易、成本低廉且对实验室的设备及技术人员的要求不高，因此能在更广泛的范围内进行疾病的监测和预警，对我国的疾控事业将会起到一个有利的促进作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1.沙门氏菌的CRISPR分型示意图；
[0025]图2.沙门氏菌CRISPR的PCR扩增电泳图谱；
[0026]图3.沙门氏菌血清型分型和CRISPR分型的一致性分析图；
[0027]图4A.沙门氏菌PFGE图谱；
[0028]图4B.沙门氏菌PFGE图谱；
[0029]图5A.MLST分型分辨率示意图；
[0030]图5B.CRISPR分型分辨率示意图； [0031 ]图5C.PFGE分型分辨率示意图。
【具体实施方式】[0032]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明权利要求所定义的保护范围构成任何限制。
[0033]实施例1:82株沙门氏菌的分子分型及血清型预测
[0034]1.菌株:
[0035]此次试验选取的菌株为我中心保存的来自我国多个地区82株沙门氏菌，已完成传统血清学鉴定，确定为沙门氏菌，并分属21种血清型(82株菌传统血清学分型结果见表2)。
[0036]2.引物合成:选用引物表中扩增范围最广的两对引物Al，A2和BI，B2
[0037]Al(5/ -GTRGTRCGGATAATGCTGCC-3')
[0038]A2(5/ -CGTATTCCGGTAGATBTDGATGG-3')
[0039]BI (5' -GAGCAATACYYTRATCGTTAACGCC-3')
[0040]B2(5/ -GTTGCDATAKGTYGRTRGRATGTRG-3')
[0041]由上海生工公司合成(Sangon Biotech) [0042]3.细菌基因组DNA提取:
[0043]细菌基因组DNA的抽提使用天根公司(Tiangen Biotech)的细菌DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)，按说明书操作。提取的DNA于_20°C保存。
[0044]4.PCR 扩增 CRISPR 位点:
[0045]PCR反应体系:
[0046]
【权利要求】
1.一种沙门氏菌的CRISPR分型方法，所述方法包括以下步骤: (1)提取待检测菌株培养物的DNA； (2)分别取适量的步骤⑴DNA提取物，进行CRISPR1位点和CRISPR2位点的PCR扩增，其中CRISPR1位点扩增的上游引物为SEQ ID NO:1，下游引物选自SEQ ID NO:2_7中的一种；CRISPR2位点扩增的上游引物为SEQ ID NO:8，下游引物选自SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10 ； (3)分别对步骤(2)所述CRISPR1位点的扩增产物和所述CRISPR2位点的扩增产物； (4)确定CRISPR1位点序列和CRISPR2位点序列中的最新间隔序列，根据二者的间隔序列组合确定所述沙门氏菌的CRISPR型别。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的CRISPR1位点扩增用的下游引物为SEQ ID NO:2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的CRISPR2位点扩增用的下游引物为SEQ ID NO:9。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的DNA测序为反向引物测序，所用引物为步骤⑵所述PCR扩增的下游引物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的最新间隔序列分别为CRISPR1位点和CRISPR2位点的最后两个重复序列之间的序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的最后两个重复序列由SEQID NO:11所示。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(5):通过待检测菌株的CRISPR型别确定所述菌株的血清型。
【文档编号】C12Q1/04GK103981256SQ201410147709
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】宋宏彬, 邱少富, 李 浩, 李鹏, 易胜杰, 谢靖, 吴志豪, 郝荣章, 王立贵, 柳楠, 杨超杰 申请人:中国人民解放军疾病预防控制所