一种优化的电穿孔技术转染悬浮细胞的方法
【专利摘要】本发明属于哺乳动物细胞基因工程领域，具体是一种优化的电穿孔技术转染悬浮细胞的方法，特别是适用于难转染的CEMx174细胞系。其特征是用含10％血清的RPMI-1640细胞培养基为电穿孔缓冲液，以合适的浓度混合细胞与外源DNA，然后使用电穿孔仪进行电转染，将外源DNA导入细胞内。本方法不需要特殊制备的电转缓冲液以及其他转染试剂，可方便快速的将外源DNA导入细胞，同时获得较高的悬浮细胞转染效率。
【专利说明】一种优化的电穿孔技术转染悬浮细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于哺乳动物细胞基因工程领域，具体是一种优化的电穿孔技术转染悬浮细胞的方法，特别是适用于难转染的CEMX174细胞系。
【背景技术】
[0002]转染是将外源核酸导入真核细胞中并发挥其生物学作用的一种技术，导入的核酸包括DNA (质粒和线性双链DNA)，反义寡核苷酸及RNAi (RNA interference) 0目前，基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究(基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究)和基因治疗研究。
[0003]转染技术根据时效可分为瞬时转染和稳定转染两大类。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，可导入多个拷贝，获得目的基因暂时的高水平表达，适用于在转染后I~4天内收获细胞，检测目的基因表达结果的实验。稳定转染是用于建立单克隆的细胞系，使得目的基因整合到靶细胞染色体中或者以游离形态稳定存在于持续传代培养的细胞中，指导目的基因的适量表达。一般来说，稳定转染的表达效率比瞬时转染低I~2个数量级，但是效果更持续稳定，重复性好。通常利用可选择的遗传标记物用药物筛选出转染成功的细胞，建立单克隆细胞系，如G418 (新霉素抗性)，氨喋呤(胸苷激酶抗性)，嘌呤霉素(嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶抗性)。
[0004]现今常用的转染方法可归为三类:生化方法，病毒介导的方法以及物理方法。
[0005]生化方法是实验室中最为常用的一种，是通过转染试剂与核酸形成复合物后易化核酸接近贴壁的细胞并促进细胞的内吞作用使核酸进入细胞内，常用DEAE-葡聚糖法，磷酸钙法，脂质体法等。但是由于细胞膜结构的差异，或是悬浮团簇状生长的方式降低了复合物与细胞接触的几率，这类转染方法对于悬浮细胞效果甚不理想。虽然有很多号称可以转染悬浮细胞的新型改良试剂，但其结果依然差强人意。
[0006]病毒介导的转染通常是用逆转录病毒载体。它属于RNA病毒，可在靶细胞内反转录产生DNA互补链，此DNA单链可作为模板合成第二条DNA链，第二条DNA链可掺入细胞基因组DNA中。此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制，RNA可合成蛋白，再包装病毒，从胞内释放，成为感染性病毒，其介导的过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。理论上，这种逆转录病毒载体介导的转染方法可以获得较高的转染效率，但是其前期的准备工作繁琐复杂，且存在一定的安全风险，不适合广泛的应用。而且，根据本室的实践研究，该方法转染悬浮细胞的结果也并不理想。
[0007]而常用的物理方法有两种:通过直接显微注射将细胞膜穿孔并导入核酸，或利用短暂的电流脉冲在质膜上瞬时形成可让核酸通过的微孔并使核酸在电场作用下主动进入细胞。前者主要用于转基因动物的制备，不适于大量细胞的转染。而电穿孔技术的应用范围则更广泛，可以快速、简便、有效的将DNA导入包括细菌、酵母、植物细胞与多种培养的哺乳动物细胞中。
[0008]CEMx174细胞系是人T、B淋巴母细胞杂交株，由721.174(LCL721B淋巴母细胞系变种)和CEMR.3 (CEM T淋巴母细胞系的氮鸟嘌呤和乌巴音抵抗克隆株)杂交得来(SalterRD, Howell DN, 1985) ? 该细胞株表达 CXCR4 (Strizki JM et al，1997)，CCR5 (Miyagi T etal，2000)，孤儿受体GPR15(Kiene M et al，2012)等，是重要的SIV及HIV感染的细胞模型，广泛用于病毒感染的机制以及临床药物作用的研究(Dong MX et al,2012 ；Lim HG et al,2008 ；Newman JT et al，2007)。同时，CEMxl74细胞系也表达阿片受体(μ / κ / Λ )，因此经常用于吗啡等阿片类药物的作用机理研究及临床应用研究(Miyagi T et al,2000 JinXu et al,2004 ；Han Liu et al，2009)。然而，CEMxl74细胞系与其他的淋巴细胞系(如Jurkat, U937等)具有相同的生长特性，呈悬浮团簇状生长在培养液中，同样，转染效率非常低，经常严重的阻碍实验研究的进行。常用的脂质体转染试剂或阳离子转染试剂都不能达到让人满意的效果，转染效率低而且重复性差，直接干扰了后续实验的进行，对实验结果的可信度和可靠性造成干扰。
[0009]对于这类常规转染方法无计可施的悬浮细胞细胞系来说，电穿孔法是一种简便高效的方法。但是电穿孔的条件对于结果影响非常大，电流脉冲的强度和时间，以及电转缓冲液的选择都会严重的影响细胞的转染效率及生存率。但由于细胞膜结构的差异，不同细胞系的电穿孔条件有时会有很大的差异，而电穿孔仪器优良的性能往往会提供十分宽泛的电击强度及时间范围，因此最优条件的筛选是电转染的一大难题。当然一些制造生物仪器的公司已针对最常见的细胞系拟定了具体的电穿孔条件，或者在机器内部预设了相关的程序，可获得较高的转染效率，但其配套的耗材或者缓冲液往往昂贵，预设的条件更是将范围固定在特定仪器，不利于广泛应用。
[0010]本发明即是为了改变这种现状，经过筛选得到了一组优化的悬浮细胞转染条件范围，而使其能广泛用于多种电穿孔设备，而且所需耗材皆为实验室中常规耗材，电转缓冲液则使用离子浓度较低的RPM1-1640培养液，同时，在参考文献资料后加入10%的血清，起到保护细胞的作用，提高电刺激后细胞的存活率。进而又针对CEMxl74系进行了更细致的优化，将电穿孔条件固定为4mm电极杯，以预热的RPM1-1640培养液(含10%血清)为电转缓冲液，脉冲强度210v，脉冲时间30ms，电击一次。经过多次验证，该条件可获得至少> 50%的转染效率。
【发明内容】
[0011]本发明开发了一种用普通商用电穿孔仪快速高效转染悬浮细胞的方法，特别是淋巴细胞系CEMxl74细胞系。
[0012]CEMx174细胞系是人T、B淋巴母细胞杂交株，由721.174(LCL721B淋巴母细胞系变种)和CEMR.3 (CEM T淋巴母细胞系的氮鸟嘌呤和乌巴音抵抗克隆株)杂交得来。细胞在含有10%血清的RPM1-1640培养基中培养，以团簇形态悬浮生长。
[0013]本发明是以预热37°C的RPM1-1640细胞培养基(含10%血清)为电穿孔缓冲液，以合适的浓度分别重悬细胞与外源DNA，混合后转移到4_的电极杯中，使用普通商业化电穿孔仪为BTX公司ECM830细胞电融合仪，电击条件为LV模式下以210mV脉冲电击一次，持续时间30ms，主要包括以下步骤:
[0014]1.细胞培养。细胞培养于RPM1-1640完全培养液中(含10%血清)，在状态良好处于对数生长期时收集用作实验。[0015]2.培养液预热。根据实验的需求取适量培养液加入孔板或平皿中，在电转染实验操作开始之前放入37°C的C02培养箱中预热。
[0016]3.收集计数细胞。将细胞收集在一起，轻柔混匀，取出少量细胞计数，根据计数结果量取适量的细胞悬液，800rpm(90g)离心10min，尽量吸净上清，以一定量预热的完全培养基重悬细胞，使细胞与DNA稀释液混合后的终浓度达到I X 107。
[0017]4.稀释DNA。收集细胞的同时，取适量转染级DNA同样用适量的预热培养基稀释，体积不超过总体积的1/6。所需质粒的质量与质粒大小成正比，即每100 μ I体系需要Ikb的质粒量为I μ go
[0018]5.电转染。轻柔混匀细胞悬液和DNA稀释液，转移到4mm的BTX电极杯中，合上杯盖，放入电极槽。电转条件:4mm电极杯，电压210v，脉冲长度30ms，脉冲次数I次。
[0019]6.转染后复苏。轻柔移除电转产生的细胞碎片，将余下的部分转移至预热的培养液中，放回37°C的恒温二氧化碳培养箱中。18h~48h后检测，或是筛选稳定转染细胞株。
[0020]7.按照以上步骤，转染CEMX 174细胞是本【技术领域】的技术人员能够实现的。本实验开发的转染CEMX 174细胞的方法，基于电穿孔转染细胞的基本原理，在全过程中使用预热的完全培养基作为缓冲液，是细胞出于温和的条件下，提高了电转后细胞的存活率。同时在电穿孔仪能够产生的条件范围中进行了仔细的筛选，优化了电转的条件，210v下30ms的脉冲刺激既能保证细胞孔隙的开放不影响细胞的存活，又能保证有足够的时间空间让外源DNA能够有效的进入细胞。整个转染过程简单易操作，且突破了 CEMX 174细胞难转染这一技术屏障，使得转染效率有了非常大的提高，为后续的研究及应用奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是使用本发明所述方法在CEMx174中转染pEGFP_Nl质粒，24h后在荧光显微镜下观察结果。
[0022]图2是使用脂质体转染试剂Lipofetmiane2000 (Invitrogen)在CEMxl74中转染pEGFP-ΝΙ质粒，24h后在荧光显微镜下观察结果。
[0023]图3是使用非脂质体转染试剂MegaTranl.0 (Origene)在CEMx174中转染pEGFP-ΝΙ质粒，24h后在荧光显微镜下观察结果。
[0024]图4是在使用发明所述方法的基础上，分别用预热加血清，预热不加血清及加血清不预热培养液作为电转缓冲液进行电转染的结果。
[0025]图5是在使用发明所述方法基础上，分别使用不同量的质粒进行电转染的结果，自左至右分别为 3 μ g,6 μ g,9 μ g, 14.1 μ g, 30 μ go
【具体实施方式】
[0026]实施例1:以三种不同方法在CEMxl74细胞系中转染pEGFP_Nl质粒
[0027]1.以发明所述方法转染。
[0028]I)细胞培养于RPM1-1640完全培养液中(含10%血清)，以I X IO5~2X IO5的初始浓度传代 ，传代后在37°C CO2培养箱中培养24h后，在细胞状态良好的条件下用于电转染实验。
[0029]2)取2ml RPM1-1640完全培养液(含10%血清)加入六孔板中，另取一支1.5ml印管，向其中加入1ml RPM1-1640完全培养液中(含10%血清)。将六孔板和印管放入37 °C的CO2培养箱中预热。
[0030]3)放好需要预热的培养液之后，取出培养的对数期细胞，收集在一起，轻柔混匀，取出10 μ I细胞培养液计数，根据计数结果量取适量的细胞悬液，使其总细胞量达到3X106，800rpm(90g)离心10min，尽量吸净上清。取出1.5ml印管，用管中预热的培养液250 μ I重悬细胞，使细胞与DNA稀释液混合后的终浓度达到I X IO70
[0031]4)收集细胞的同时，取去内毒素的转染级pEGFP-Nl质粒14.1 μ g，同样用预热培养基稀释，终体积50 μ I。(pEGFP-Nl质粒为4.7kb)
[0032]5)轻柔混匀细胞悬液和DNA稀释液，转移到4mm的BTX电极杯中，合上杯盖，放入电极槽。电转条件:4mm电极杯，电压210v，脉冲长度30ms，脉冲次数I次。
[0033]6)轻柔移除电转产生的细胞碎片，将余下的部分转移至预热的培养液中，放回370C CO2培养箱中培养24h，在正置荧光显微镜下观察转染效果(图1)。细胞存活率约为80 %，转染后成功表达目的蛋白的细胞大于70 %。
[0034]2.使用 Lipofetmiane2000 (Invitrogen)试剂进行转染
[0035]I)细胞培养于RPM1-1640完全培养液中(含10%血清)，以I X IO5~2X IO5的初始浓度传代，传代后在37°C CO2培养箱中培养24h后，在细胞状态良好的条件下用于转染。
[0036]2)取出培养的对数期细胞，800rpm(90g)离心10min收集在一起，以一定量的预热的完全培养液轻柔重悬，取出IOul细胞培养液计数，在配制转染液前每孔4-8 X IO5个细胞接种于500 μ I不含抗生素的完全培养基中(以24孔板转染)。
[0037]3)用50 μ I Opt1-MEM无血清培养基稀释质粒DNA0.8ug，轻轻混匀。
[0038]4)使用前轻轻摇匀 Lipofectamine2000,然后取适量 2ul Lipofectamine2000 在50 μ I Opt1-MEM培养基中稀释，室温孵育5分钟。
[0039]5)将前两步所稀释的DNA和Lipofectamine2000混合(使总体积为100 μ I)，轻轻混匀，室温放置20分钟(溶液可出现浑浊)。
[0040]6)在每孔细胞中加入100 μ I转染液，轻轻摇匀。
[0041]7)37°C培养24小时后在正置荧光显微镜下观察转染效果，细胞存活率小于10%，转染后成功表达目的蛋白的细胞小于50% (图2)。根据生产商说明书优化转染条件后试验，转染后成功表达率仍小于50%，不再附图赘述。
[0042]3.使用一种非脂质体聚合物转染试剂MegaTranl.0(Origene)进行转染:
[0043]I)细胞培养于RPM1-1640完全培养液中(含10%血清)，以I X IO5~2X IO5的初始浓度传代，传代后在37°C CO2培养箱中培养24h后，在细胞状态良好的条件下用于转染。
[0044]2)取出培养的对数期细胞，800rpm(90g)离心10min收集在一起，以一定量的预热的完全培养液轻柔重悬，取出IOul细胞培养液计数，在配制转染液前每孔5 X IO5个细胞接种于900 μ I不含抗生素的完全培养基中(以24孔板转染)。
[0045]3)用100μΙ Opt1-MEM无血清培养基稀释质粒DNAlug，轻轻混匀。加入3ulMegaTranl.0，立即混匀10s，室温孵育10分钟。
[0046]4)每孔中加入上述100 μ I的转染液，轻轻摇匀。
[0047]5)37°C培养24小时后在正置荧光显微镜下观察转染效果，细胞存活率小于30%，转染后成功表达目的蛋白的细胞小于50% (图3)。根据生产商说明书优化转染条件后试验，转染后成功表达率仍小于50%，不再附图赘述。
[0048]实施例2:pEGFP-Nl质粒电转染CEMxl74细胞系。
[0049]1.细胞培养于RPM1-1640完全培养液中(含10%血清)，以I X IO5~2X IO5的初始浓度传代，传代后在37°C CO2培养箱中培养24h后，在细胞状态良好的条件下用于电转染实验。
[0050]2.取三个35mm的细胞培养皿，每个加入2ml RPM1-1640完全培养液(含10%血清)，两个放入37°C的CO2培养箱中预热，另一个室温放置。
[0051]3.另取出三支1.5ml ep管，向其中两支加入1ml RPM1-1640完全培养液中(含10%血清)，另一支加入不加血清的RPM1-1640培养液。将两支印管(一支加血清，一支不加)放入37°C的CO2培养箱中预热，另一支加血清的印管室温放置。
[0052]4.放好培养液之后，取出培养的对数期细胞，收集在一起，轻柔混匀，取出IOul细胞培养液计数，根据计数结果量取三份细胞悬液，使其各自总细胞量达到3X 106，800rpm(90g)离心10min,尽量吸净上清。取出三支1.5ml ep管,分别用管中预热加血清，预热未加血清和未经预热的培养液250ul重悬细胞，使细胞与DNA稀释液混合后的终浓度达到IXlO70
[0053]5.收集细胞的 同时，每份取去内毒素的转染级pEGFP-Nl质粒14.1 μ g，分别用上述三种培养液稀释，终体积50 μ I。(pEGFP-Nl质粒为4.7kb)
[0054]6.分别一一对应混合细胞悬液和DNA稀释液，轻柔混匀，转移到4mm的BTX电极杯中,合上杯盖,放入电极槽。电转条件:4mm电极杯，电压210v，脉冲长度30ms，脉冲次数I次。
[0055]7.轻柔移除电转产生的细胞碎片，将余下的部分转移至预热的培养液中，其中使用未预热缓冲液的一组加入未预热培养液中，一起放回37°C CO2培养箱中培养24h，在正置荧光显微镜下观察转染效果。结果显示，使用发明所述预热的加血清培养液作为电转缓冲液转染效率最高，且细胞死亡率低；使用不加血清的培养液或者未经预热的培养液作为缓冲液，细胞死亡率均明显高于前者，且转染效率低，结果如说明书附图中所示(图4)。
[0056]实施例3:pEGFP-Nl质粒电转染CEMxl74细胞系。
[0057]1.细胞培养于RPM1-1640完全培养液中(含10%血清)，以I X IO5~2X IO5的初始浓度传代，传代后在37°C CO2培养箱中培养24h后，在细胞状态良好的条件下用于电转染实验。
[0058]2.取2ml RPM1-1640完全培养液(含10%血清)加入六孔板中，总共三十二孔，另取IOml RPM1-1640完全培养液中(含10%血清)用于稀释DNA和重悬细胞，将上述培养液放入37°C的CO2培养箱中预热。
[0059]3.放好需要预热的培养液之后，取出培养的对数期细胞，收集在一起，轻柔混匀，取出10 μ I细胞培养液计数，根据计数结果量取适量的细胞悬液，使每份细胞总量达到3\106，总共准备三十二份细胞，分别800印111(900离心10min，尽量吸净上清。取出预热的培养液每份250 μ I分别重悬细胞，使细胞与DNA稀释液混合后的终浓度达到I X IO70
[0060]4.收集细胞的同时，每份取去内毒素的转染级pEGFP-Nl质粒14.1 μ g，同样用预热培养基稀释，终体积50 μ I。(pEGFP-Nl质粒为4.7kb)
[0061]5.轻柔混匀细胞悬液和DNA稀释液，转移到不同规格的BTX电极杯中，合上杯盖，放入电极槽。按照不同的电击条件进行电转:
[0062]I)4mm电极杯，电压110v，脉冲长度10ms，脉冲次数I次。
[0063]2)4mm电极杯，电压210v，脉冲长度10ms，脉冲次数I次。
[0064]3)4mm电极杯，电压310v，脉冲长度10ms，脉冲次数I次。
[0065]4) 4mm电极杯，电压410v，脉冲长度10ms，脉冲次数I次。
[0066]5) 4mm电极杯，电压110v，脉冲长度20ms，脉冲次数I次。
[0067]6) 4mm电极杯，电压210v，脉冲长度20ms，脉冲次数I次。
[0068]7) 4mm电极杯，电压310v，脉冲长度20ms，脉冲次数I次。
[0069]8) 4mm电极杯，电压410v，脉冲长度20ms，脉冲次数I次。
[0070]9) 4mm电极杯，电压110v，脉冲长度30ms，脉冲次数I次。
[0071]10) 4mm电极杯，电压210v，脉冲长度30ms，脉冲次数I次。
[0072]11) 4m m电极杯，电压310v，脉冲长度30ms，脉冲次数I次。
[0073]12) 4mm电极杯，电压410v，脉冲长度30ms，脉冲次数I次。
[0074]13) 4mm电极杯，电压210v，脉冲长度30ms，脉冲次数I次。
[0075]14) 4mm电极杯，电压210v，脉冲长度30ms，脉冲次数2次。
[0076]15) 4mm电极杯，电压210v，脉冲长度30ms，脉冲次数3次。
[0077]16) 4mm电极杯，电压210v，脉冲长度30ms，脉冲次数4次。
[0078]17) 2mm电极杯，电压110v，脉冲长度10ms，脉冲次数I次。
[0079]18) 2mm电极杯，电压210v，脉冲长度10ms，脉冲次数I次。
[0080]19) 2mm电极杯，电压310v，脉冲长度10ms，脉冲次数I次。
[0081]20) 2mm电极杯，电压410v，脉冲长度10ms，脉冲次数I次。
[0082]21) 2mm电极杯，电压110v，脉冲长度20ms，脉冲次数I次。
[0083]22) 2mm电极杯，电压210v，脉冲长度20ms，脉冲次数I次。
[0084]23) 2mm电极杯，电压310v，脉冲长度20ms，脉冲次数I次。
[0085]24) 2mm电极杯，电压410v，脉冲长度20ms，脉冲次数I次。
[0086]25) 2mm电极杯，电压110v，脉冲长度30ms，脉冲次数I次。
[0087]26) 2mm电极杯，电压210v，脉冲长度30ms，脉冲次数I次。
[0088]27) 2mm电极杯，电压310v，脉冲长度30ms，脉冲次数I次。
[0089]28) 2mm电极杯，电压410v，脉冲长度30ms，脉冲次数I次。
[0090]29) 2mm电极杯，电压210v，脉冲长度30ms，脉冲次数I次。
[0091]30) 2mm电极杯，电压210v，脉冲长度30ms，脉冲次数2次。
[0092]31) 2mm电极杯，电压210v，脉冲长度30ms，脉冲次数3次。
[0093]32) 2mm电极杯，电压210v，脉冲长度30ms，脉冲次数4次。
[0094]6.轻柔移除电转产生的细胞碎片，将余下的部分转移至预热的培养液中，放回370C CO2培养箱中培养24h，在正置荧光显微镜下观察转染效果。结果显示，本发明所述条件在保证足够的细胞存活率的同时有明显优于其他条件的转染效率。具体结果过于庞杂不列图说明。
[0095]实施例4:pEGFP-Nl质粒电转染CEMxl74细胞系。
[0096]1.细胞培养于RPM1-1640完全培养液中(含10%血清)，以I X IO5~2X IO5的初始浓度传代，传代后在37°C CO2培养箱中培养24h后，在细胞状态良好的条件下用于电转染实验。
[0097]2.取2ml RPM1-1640完全培养液(含10%血清)加入六孔板中，共五孔，另取一支1.5ml ep管，向其中加入1.5ml RPM1-1640完全培养液中(含10%血清)。将六孔板和ep管放入37°C的CO2培养箱中预热。
[0098]3.放好培养液之后，取出培养的对数期细胞，收集在一起，轻柔混匀，取出IOul细胞培养液计数，根据计数结果量取细胞悬液，使每份细胞总量达到3X106，800rpm(90g)离心lOmin，尽量吸净上清。取出五支1.5ml印管，分别用管中预热加血清培养液250ul重悬细胞，使细胞与DNA稀释液混合后的终浓度达到I X IO70
[0099]4.收集细胞的同时，取5组不同浓度的去内毒素的转染级pEGFP-Nl质粒，用上述培养液稀释，终体积50 μ I。(pEGFP-Nl质粒为4.7kb)五组分别取:3 μ g,6 μ g,9 μ g,14.1 μ g，30 μ g0
[0100]5.分别轻柔混匀细胞悬液和DNA稀释液，转移到4mm的BTX电极杯中，合上杯盖，放入电极槽。电转条件:4mm电极杯，电压210v，脉冲长度30ms，脉冲次数I次。 [0101]6.轻柔移除电转产生的细胞碎片，将余下的部分转移至预热的培养液中，其中使用未预热缓冲液的一组加入未预热培养液中，一起放回37°C CO2培养箱中培养24h，在正置荧光显微镜下观察转染效果。结果显示，使用本发明所述比例的质粒量可达到最好转染效果；使用30ug质粒(即lOOug/ml)转染后表达绿色荧光蛋白的细胞比例并没有明显增加，但是细胞死亡率增加；使用其他比例的质粒量转染效率明显低于发明所述实验组，结果如说明书附图中所示(图5)。
【权利要求】
1.一种转染悬浮细胞的方法，其特征在于以预热的含10%血清的RPM1-1640细胞培养基为电穿孔缓冲液，混合细胞与外源DNA混合，然后用电转化系统进行电转染，将外源DNA导入细胞内。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的电转染缓冲液不含抗生素。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的预热环境为37°C恒温细胞培养箱。
4.一种转染人CEMX 174细胞系的方法，CEMX 174细胞系为人T、B淋巴母细胞杂交系，其特征在于，以预热的含10%血清的RPM1-1640细胞培养基为电穿孔缓冲液，将细胞与外源DNA混合，然后用电转化系统进行电转染，将外源DNA导入细胞内，预热温度为37°C，所述细胞培养基不含抗生素。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于电转体系中细胞浓度是5X IO6~IXlO7个细胞/ml。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于电转染条件为，在4mm电极杯中以210mV脉冲电击一次，持续时间30ms。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于转染过程中，细胞浓度:质粒线性长度:质粒重量比为106: 1kb: 1μ g.
【文档编号】C12N15/85GK103981218SQ201410166759
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】侯雯婷, 蒋卫, 李慧, 张超, 李刚 申请人:北京大学