一种具有缓解肝损伤作用的组合物及其制备方法及含量测定方法
【专利摘要】本发明提供了一种具有缓解肝损伤作用的组合物及其制备方法，该组合物由葛根、白芍、五味子、余甘子、枳椇子、姜黄提取物和番茄红素组成。本发明还提供了一种该组合物的含量测定方法。本发明组合物可以用于制备缓解肝损伤的保健品。
【专利说明】一种具有缓解肝损伤作用的组合物及其制备方法及含量测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及保健品领域，特别涉及一种具有缓解肝损伤作用的保健品组合物。
【背景技术】
[0002]肝脏损伤是由病毒、药物、毒剂、酒精、缺氧等因素导致的肝脏病理改变。肝损伤的发生机制较为复杂，可分为化学性和免疫性两种。化学机制主要是通过质膜的损害、自由基损害、线粒体功能失调、代谢紊乱等。化学性肝损伤可因酒精、环境中的化学毒物及某些药物的作用而引起。
[0003]现代医学研究证明，质膜损害是肝细胞(HC)受损的最基本表现。细胞膜结构和功能的受损，可使肝脏可溶性酶的活性升高，进而不能保持正常的膜流动性和电解质的平衡，尤其是钙离子的稳态失调，使细胞内钙堆聚，最终引起细胞坏死。
[0004]此外，身体受有害物质的损伤后，导致自由基大量产生和抗氧化物显著减少，引起组织细胞的脂质发生过氧化连锁反应，从而破坏组织细胞的正常结构，影响其正常代谢和功能，出现组织细胞损伤性变化。脂质过氧化反应是肝损伤发生的重要机制。脂质过氧化的主要降解产物丙二醛(MDA)，可严重损伤肝细胞膜结构，导致HC的肿胀、坏死。
[0005]改善肝脏的供血供氧是缓解肝损伤的重要环节之一。肝脏正常的血液循环对维持肝脏正常的生理功能有十分重要的意义。如果血流减慢易使各种炎症细胞附壁聚集，造成和加重局部的炎症反应。同时，缺血缺氧使肝细胞线粒体内尼克酞胺腺嗓吟二核昔酸的氧化型和还原型的比例下降，三磷酸腺苷(ATP)酶受抑制，出现细胞内ATP耗竭和酸中毒，持续缺氧使细胞内Ca浓度上升，激活蛋白、脂质和DNA的降解，形成以小叶中央区为主的肝组织变性、坏死。
[0006]缓解肝损伤的另一重要环节是促进HC再生。HC有强烈的再生能力，促进HC的再生是改善肝脏功能、提高患者生存力的重要手段和环节。
[0007]目前，临床上大部分化学性肝损伤是由酒精引起，即酒精性肝病。
[0008]酒精性肝病(alcoholicliverdisease, ALD),是由于长期大量饮酒所致的肝脏疾病，其发病率高，后果严重，已成为一种严重危害人民健康的疾病。过量饮酒是当今世界范围内一个重要的公共卫生问题，它不仅危害社会治安，且严重影响身体健康。酒精性肝病是西方国家中肝硬化的主要致病因素，据统计，20世纪80年代美国肝硬化患病率为360/1000人口，其中40%?90%为酒精相关性肝病，每10万人口中酒精性肝硬化死亡率为4.4。近年来，我国酒类产量逐年增加，从1984年产711.3万吨，1993年的1846万吨，到2000年的20万吨，酒精性肝病也有随之增加之趋势，据估计，20世纪90年代酒精性肝病的发病率较20世纪80年代以前约增加了 30倍。由此可见，随着我国人民生活条件的日益改善，我国酒精消耗量呈直线上升，因而我国近年来酒精性肝病的发生有明显增多的趋势。
[0009]目前为止，在国家食品药品监督管理总局已审批的抗肝损伤类保健品有254种，其中审批已上市保肝类产品较为有名的:海王金樽(成分牡蛎粉提取物，偏向于解酒)；昂立多邦(乳酸杆菌，维生素C、E、B1、B2、B6、葡萄糖酸锌，)；安泰胶囊(卵白蛋白、珍珠粉，解酒、肝腹水、肝硬化、脂肪肝)；大汉灵芝(灵芝多肽、多糖，免疫力低下者、有化学性肝损伤危险者及肝病患，偏向于肿瘤)；“陪酒师”解酒茶(紫葛花、葛根、枳犋子、低聚木糖醇、富硒野山茶，能醒酒护肝、健胃、养生)；莱福宝保肝丸(新西兰，主要成分为圣玛利草精华素、维生素E、维生素C等精制而成，可防止病毒侵入肝细胞，强肝功能，促进胆汁分泌，分解肝脏脂肪并排除进入血液的毒素)。
[0010]与上市品种相比，本发明组合物采用药食同源的植物品种，长期服用对人身体没有毒副作用；同时，本发明组合物能够降低脂质过氧化产物丙二醛、清除超氧自由基、减轻肝纤维化病变，有效降低肝脏病理性损伤。
[0011]本发明组合物能够有效改善肝损伤模型的生化指标，特别是酒精性肝损伤模型，具有的一定缓解肝损伤的作用。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是提供一种具有缓解肝损伤作用的组合物；
[0013]本发明的另一目的是提供该组合物的制备方法；
[0014]本发明的再一个目的是提供该组合物在制备具有缓解肝损伤作用的保健品组合物中的应用。
[0015]本发明的再一个目的是提供一种该组合物的含量测定方法。
[0016]本发明通过以下方式实现:
[0017]一种具有缓解肝损伤作用的组合物，其特征在于，该组合物是由包含以下重量份的成分组成:葛根4?6重量份、白苟I?3重量份、五味子0.50?2重量份、余甘子2?4重量份、枳犋子3?6重量份、姜黄提取物0.10?0.25重量份、番茄红0.05?0.20重量份。
[0018]上述组合物优选以下重量份的成分组成:葛根4重量份、白芍I重量份、五味子0.50重量份、余甘子2重量份、枳犋子3重量份、姜黄提取物0.10重量份、番茄红素0.05重量份。
[0019]上述组合物优选以下重量份的成分组成:葛根6重量份、白芍3重量份、五味子2重量份、余甘子4重量份、枳犋子6重量份、姜黄提取物0.25重量份、番茄红素0.20重量份。
[0020]上述组合物优选以下重量份的成分组成:葛根5重量份、白芍2重量份、五味子I重量份、余甘子3重量份、枳犋子0.45重量份、姜黄提取物0.15重量份、番茄红素0.10重量份
[0021]上述组合物中还可以加入常用辅料，包括但不限于微晶纤维素、硬脂酸镁、交联羧甲基纤维素钠、甲基硅油、乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇、玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP或聚维酮)或磷酸钙。
[0022]一种具有缓解肝损伤作用的组合物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤:
[0023](I)葛根、白芍、五味子加6?10倍量50%?80%乙醇，提取2?4次，每次I?3小时，提取液浓缩至1.00?1.30，减压干燥，粉碎，得到干粉A ;
[0024](2)余甘子、枳犋子加6?10倍量水，提取2?4次，每次I?3小时，提取液浓缩至1.0O?1.30，减压干燥，粉碎，得到干粉B ;
[0025](3)干粉A、干粉B混合，加入姜黄提取物及番茄红素，混匀，加入辅料，得所需制剂。
[0026]所述制剂包括片剂、丸剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂。
[0027]优选的，该制备方法包括以下步骤:
[0028](I)葛根、白芍、五味子加8倍量60%乙醇，提取3次，每次2h，提取液浓缩至1.20，减压干燥，粉碎，得到干粉A ;
[0029](2)余甘子、枳犋子加8倍量水，提取3次，每次1.5h，提取液浓缩至1.20，减压干燥，粉碎，得到干粉B ；
[0030](3)干粉A、干粉B混合，加入姜黄提取物及番茄红素，混匀，加入辅料，得所需制剂。
[0031]一种具有缓解肝损伤作用的组合物的含量测定方法，其特征在于，该测定方法包括以下步骤:
[0032](I)供试品溶液制备；
[0033](2)取没食子酸、葛根素、姜黄素对照品溶于甲醇，制备混合对照品溶液；
[0034](3)利用高效液相色谱法在三波长条件下，同时测定供试品溶液中没食子酸、葛根
素和姜黄素的含量；
[0035]色谱条件为:HPLC色谱柱为C18，以甲醇或乙腈为流动相A，以0.2%磷酸或4%乙酸为流动相B，梯度洗脱程序为O — 15min，A为2?5%，B为98?95%;15 — 16min，A从2?5%上升到12?17%，B从98?95%下降到88?83%;16 — 45min，A从12?17%上升到40?60%，B从88?83%降到60?40% ；45 — 46min，A从40?60%上升到75?85%, B 从 60 ?40%下降到 25 ?15% ；46 — 55min, A 为 75 ?85%，B 为 25 ?15% ;柱温 20 ?400C ;流速 0.8 ?1.2mL.mirT1 ;检测波长 273nm、250nm、430nm ；
[0036](4)根据高效液相色谱分析结果计算供试品中没食子酸、葛根素和姜黄素的含量。
[0037]优选的，供试品溶液是依照以下步骤制备:
[0038](I)取葛根5重量份、白芍2重量份、五味子I重量份、余甘子3重量份、枳犋子4.5重量份、姜黄提取物0.15重量份、番茄红素0.10重量份；
[0039](2)葛根、白芍、五味子加8倍量60%乙醇，提取3次，每次2h，提取液浓缩至1.20，减压干燥，粉碎，得到干粉A ;
[0040](3)余甘子、枳犋子加8倍量水，提取3次，每次1.5h，提取液浓缩至1.20，减压干燥，粉碎，得到干粉B ；
[0041](4)干粉A、干粉B混合，加入姜黄提取物及番茄红素，混匀，加入辅料，得所需制剂；
[0042](5)取0.1g制剂研细后于50mL容量瓶中加入甲醇或乙醇至刻度，超声提取30min，用甲醇或乙醇定容，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
[0043]优选的，对照品溶液按以下步骤制备:取没食子酸、葛根素和姜黄素对照品适量于50mL容量瓶中，加入25mL甲醇或，待姜黄素完全溶解后，用水定容至刻度，摇匀，制得含没食子酸30 μ g/mL、葛根素40 μ g/mL、姜黄素10 μ g/mL的混合对照品溶液。
[0044]优选的，色谱条件为:HPLC色谱柱为Waters C18,以甲醇流动相A，以0.2%磷酸或4%乙酸为流动相B，梯度洗脱程序为O — 15min，A为3%，B为97% ; 15 — 16min，A从3%上升到15%，B从97%下降到85% ；16 — 45min, A从15%上升到50%，B从85%降到50% ；45 — 46min, A 从 50%上升到 80%，B 从 50%下降到 20% ；46 — 55min, A 为 80%，B为 20% ;柱温 300C ;流速 1.0mL.mirT1 ;检测波长 273nm、250nm、430nm。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1提取溶剂考察图谱，依次为30%乙醇、50%乙醇、30%甲醇、50%甲醇和70%甲醇。
[0046]图2流动相考察图谱，依次为甲醇-4%乙酸、乙腈-4%乙酸、乙腈-0.2%磷酸、甲醇-0.2%磷酸。
[0047]图3样品含量测定图谱。
[0048]对本发明组合物药效学的研究与说明:
[0049]发明人对本发明提供的技术方案进行了实验研究，用来证明本发明的技术效果，下述实验用于进一步说明本发明的技术效果，但不限制本发明。
[0050]实验例1:本发明组合物抗酒精性肝损伤的作用研究
[0051]1.实验材料
[0052]1.1 动物
[0053]ICR小鼠，清洁级，18?22g，雄性，购自扬州大学比较医学中心，合格证号:SCXK (苏)27 ?0001。
[0054]1.2药物与试剂
[0055]无水乙醇:南京化学试剂有限公司，批号:09071610663 ；
[0056]冰醋酸:南京化学试剂有限公司，批号:081010779 ；
[0057]丙二醛(MDA)测定试剂盒、谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒、甘油三酯测定试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒:南京建成生物工程研究所。
[0058]1.3 仪器
[0059]电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。
[0060]紫外分光光度计UV?2550，日本岛津公司。
[0061]电子恒温水浴锅DK?S26，型，上海精宏实验设备有限公司；
[0062]CENTRIFUGE5804R 冷冻离心机，Eppendorf 公司。
[0063]2.实验方法
[0064]2.1分组与剂量设置
[0065]空白组:给予蒸馏水，0.2mL/20g体重灌胃；
[0066]模型组:给予蒸馏水，0.2mL/20g体重灌胃；
[0067]低含量组:权利要求2所述组合物，以上成分按照优选的制备方法制成制剂，按照小鼠每Ikg体重给予本组制剂0.638g的标准,蒸懼水配成溶液,0.2mL/20g体重灌胃；
[0068]中含量组:权利要求4所述组合物，以上成分按照优选的制备方法制成制剂，按照小鼠每Ikg体重给予本组制剂0.638g的标准,蒸懼水配成溶液,0.2mL/20g体重灌胃；
[0069]高含量组:权利要求3所述组合物，以上成分按照优选的制备方法制成制剂，按照小鼠每Ikg体重给予本组制剂0.638g的标准,蒸懼水配成溶液,0.2mL/20g体重灌胃；[0070]Al组:缺葛根，白芍3重量份、五味子2重量份、余甘子4重量份、枳犋子6重量份、姜黄提取物0.25重量份、番茄红素0.20重量份；以上成分按照优选的制备方法制成制剂，按照小鼠每Ikg体重给予本组制剂0.638g的标准,蒸懼水配成溶液,0.2mL/20g体重灌胃；
[0071]A2组:缺白芍，葛根6重量份、白芍3重量份、五味子2重量份、余甘子4重量份、枳犋子6重量份、姜黄提取物0.25重量份、番茄红素0.20重量份；以上成分按照优选的制备方法制成制剂，按照小鼠每Ikg体重给予本组制剂0.638g的标准,蒸懼水配成溶液，
0.2mL/20g体重灌胃；
[0072]A3组:缺五味子，葛根6重量份、白芍3重量份、余甘子4重量份、枳犋子6重量份、姜黄提取物0.25重量份、番茄红素0.20重量份；以上成分按照优选的制备方法制成制剂，按照小鼠每Ikg体重给予本组制剂0.638g的标准,蒸懼水配成溶液,0.2mL/20g体重灌胃；
[0073]A4组:缺余甘子，葛根6重量份、白芍3重量份、五味子2重量份、枳犋子6重量份、姜黄提取物0.25重量份、番茄红素0.20重量份；以上成分按照优选的制备方法制成制剂，按照小鼠每Ikg体重给予本组制剂0.638g的标准,蒸懼水配成溶液,0.2mL/20g体重灌胃；
[0074]A5组:缺枳犋子，葛根6重量份、白芍3重量份、五味子2重量份、余甘子4重量份、姜黄提取物0.25重量份、番茄红素0.20重量份；以上成分按照优选的制备方法制成制剂，按照小鼠每Ikg体重给予本组制剂0.638g的标准,蒸懼水配成溶液,0.2mL/20g体重灌胃；
[0075]A6组:缺姜黄提取物，葛根6重量份、白芍3重量份、五味子2重量份、余甘子4重量份、枳犋子6重量份、番茄红素0.20重量份；以上成分按照优选的制备方法制成制剂，按照小鼠每Ikg体重给予本组制剂0.638g的标准,蒸懼水配成溶液,0.2mL/20g体重灌胃；
[0076]A7组:缺番茄红素，葛根6重量份、白芍3重量份、五味子2重量份、余甘子4重量份、枳犋子6重量份、姜黄提取物0.25重量份；以上成分按照优选的制备方法制成制剂，按照小鼠每Ikg体重给予本组制剂0.638g的标准,蒸懼水配成溶液,0.2mL/20g体重灌胃；
[0077]AS组:缺葛根、枳犋子，白芍3重量份、五味子2重量份、余甘子4重量份、姜黄提取物0.25重量份、番茄红素0.20重量份；以上成分按照优选的制备方法制成制剂，按照小鼠每Ikg体重给予本组制剂0.638g的标准,蒸懼水配成溶液,0.2mL/20g体重灌胃；
[0078]A9组:缺葛根、枳犋子、五味子，白芍3重量份、余甘子4重量份、姜黄提取物0.25重量份、番茄红素0.20重量份；以上成分按照优选的制备方法制成制剂，按照小鼠每Ikg体重给予本组制剂0.638g的标准，蒸馏水配成溶液，0.2mL/20g体重灌胃；
[0079]AlO组:缺枳犋子、五味子，葛根6重量份、白芍3重量份、余甘子4重量份、姜黄提取物0.25重量份、番茄红素0.20重量份；以上成分按照优选的制备方法制成制剂，按照小鼠每Ikg体重给予本组制剂0.638g的标准,蒸懼水配成溶液，0.2mL/20g体重灌胃。
[0080]2.2模型制作与给药
[0081]150只ICR小鼠随机分为15组，每组10只。每日经口灌胃给予各实验组组合物，空白组、模型组给予蒸馏水。30天后，将模型组及各实验组一次灌胃50%乙醇12mL/kg体重(折合乙醇的剂量为6g/kg体重)，空白组给蒸馏水，禁食16小时处死动物，取肝脏进行肝组织中丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、甘油三酯(TG)的测定。
[0082]2.3检测指标
[0083]肝脏组织中丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)、甘油三酯(TG)含量、肝脏病理检测。[0084]3.实验结果
[0085]3.1动物一般表现
[0086]造模前，各组小鼠可正常饮食，体重逐期增长。酒精造模后，空白对照组小鼠动作自如，反应灵敏，毛发光泽；模型对照组、实验组小鼠步态不稳，活动减少。
[0087]3.2实验结果
[0088]空白组、模型组及各实验组的实验结果见表1。
[0089]表1:肝匀浆中MDA、GSH、TG含量、肝脏病理检测的结果
[0090]
【权利要求】
1.一种具有缓解肝损伤作用的组合物，其特征在于，该组合物是由包含以下重量份的成分组成: 葛根4~6重量份白苟I~3重量份五味子0.5~2重量份 余甘子2~4重量份积犋子3~6重量份 姜黄提取物0.10~0.25重量份番茄红素0.05~0.20重量份。
2.如权利要求1所述组合物，其特征在于，该组合物是由包含以下重量份的成分组成: 葛根4重量份白芍I重量份五味子0.50重量份余甘子2重量份 枳犋子3重量份姜黄提取物0.10重量份番茄红素0.05重量份。
3.如权利要求1所述组合物，其特征在于，该组合物是由包含以下重量份的成分组成: 葛根6重量份白芍3重量份五味子2重量份余甘子4重量份 枳犋子6重量份姜黄提取物0.25重量份番茄红素0.20重量份。
4.如权利要求1所述组合物，其特征在于，该组合物是由包含以下重量份的成分组成: 葛根5重量份白芍2重量份五味子I重量份余甘子3重量份 枳犋子4.5重量份姜黄提取物0.15重量份番茄红素0.10重量份。
5.如权利要求1~4所述的任一具有缓解肝损伤作用的组合物，其特征在于，该组合物中还可以加入常用辅料，包括但不限于微晶纤维素、硬脂酸镁、交联羧甲基纤维素钠、甲基硅油、乳糖、蔗糖、 甘露醇或山梨醇、玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、聚乙烯吡咯烷酮或磷酸钙。
6.一种如权利要求1所述组合物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤: (1)葛根、白芍、五味子加6~10倍量50%~80%乙醇，提取2~4次，每次I~3小时，提取液浓缩至1.00~1.30，减压干燥，粉碎，得到干粉A ; (2)余甘子、枳犋子加6~10倍量水，提取2~4次，每次I~3小时，提取液浓缩至1.00~1.30，减压干燥，粉碎，得到干粉B ； (3)干粉A、干粉B混合，加入姜黄提取物及番茄红素，混匀，加入辅料，得所需制剂。
7.如权利要求5所述制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤: (1)葛根、白芍、五味子加8倍量60%乙醇，提取3次，每次2h，提取液浓缩至1.20，减压干燥，粉碎，得到干粉A ; (2)余甘子、枳犋子加8倍量水，提取3次，每次1.5h，提取液浓缩至1.20，减压干燥，粉碎，得到干粉B; (3)干粉A、干粉B混合，加入姜黄提取物及番茄红素，混匀，加入辅料，得所需制剂。
8.—种如权利要求1所述组合物的含量测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)供试品溶液制备； (2)取没食子酸、葛根素、姜黄素对照品溶于甲醇，制备混合对照品溶液； (3)利用高效液相色谱法在三波长条件下，同时测定供试品溶液中没食子酸、葛根素和姜黄素的含量； 色谱条件为=HPLC色谱柱为C18，以甲醇或乙腈为流动相A，以0.2%磷酸或4%乙酸为流动相B，梯度洗脱程序为O — 15min，AS2~5%，BS98~95%;15— 16min, A从2~5%上升到12~17%，B从98~95%下降到88~83% ；16 — 45min，A从12~17%上升到40~60 %，B从88~83 %降到60~40 % ；45 — 46min, A从40~60 %上升到75~85%, B 从 60 ~40%下降到 25 ~15% ；46 — 55min, A 为 75 ~85%，B 为 25 ~15% ;柱温 20 ~400C ;流速 0.8 ~1.2mL.mirT1 ;检测波长 273nm、250nm、430nm ； (4)根据高效液相色谱分析结果计算供试品中没食子酸、葛根素和姜黄素的含量。
9.如权利要求8所述含量测定方法，其特征在于，所述供试品溶液是将权利要求1~5所述组合物及辅料依照权利要求6所述制备方法制成制剂，取0.1g制剂研细后于50mL容量瓶中加入甲醇或乙醇至刻度，超声提取30min，用甲醇或乙醇定容，过滤，取续滤液，即得。
10.如权利要求8所述含量测定方法，其特征在于，所述混合对照品溶液的制备方法是:取没食子酸、葛根素和姜黄素对照品适量于50mL容量瓶中，加入25mL甲醇，待姜黄素完全溶解后，用 水定容至刻度，摇匀，制得含没食子酸30 μ g/mL、葛根素40 μ g/mL、姜黄素IO μ g/mL的混合对照品溶液。
11.如权利要求8所述含量测定方法，其特征在于，优选的色谱条件为:HPLC色谱柱为Waters C18，以甲醇流动相A，以0.2%磷酸为流动相B，梯度洗脱程序为O — 15min, A为3%，B 为 97% ;15— 16min，A 从 3%上升到 15%，B 从 97%下降到 85% ;16 —45min，A 从15%上升到50%，B从85%降到50% ；45 — 46min, A从50%上升到80%，B从50%下降到 20% ；46 — 55min，A 为 80%，B 为 20% ;柱温 30°C ;流速 1.0mL ?mirT1 ;检测波长 273nm、250nm、430nmo
12.如权利要求1~5所述任一组合物，其特征在于，该组合物可以是片剂、丸剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂。
13.如权利要求1~5所述任一组合物，其特征在于，该组合物在制备抗化学性肝损伤及抗酒精性肝损伤的 保健品中的应用。
【文档编号】A23L1/29GK103948028SQ201410169732
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月20日 优先权日:2014年4月20日
【发明者】萧伟, 王振中, 王跃生, 徐振秋, 王婧, 陆艳芹, 吕耀中, 孙文凯, 范业文, 曹苗苗, 李曼曼, 刘世娟, 周恩丽, 章晨峰, 于丹 申请人:江苏康缘药业股份有限公司