一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明采用定点突变方法将来源于Bacillus?circulans?STB01的β-CGT酶的第577位天冬氨酸(Asp)分别突变为丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)，所得突变体相比于野生CGT酶，环化活力明显提高，更适合环糊精的工业化生产。
【专利说明】一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的方法，属于基因工程和酶工程领域。
【背景技术】
[0002]环糊精是由D-吡喃葡萄糖通过α -1, 4-糖苷键连接而成的环状化合物，其中以6、7和8个葡萄糖单元所构成的α-、β_和Y-环糊精最为常见。由于其呈中空圆筒状结构，具有外部亲水、内部疏水的特性，环糊精能与许多疏水客体分子形成包合物，从而改变客体分子的理化性质，因此，在食品、医药等工业领域中有着广泛的应用。
[0003]环糊精的工业化生产均采用酶法工艺，即在环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)催化作用下通过环化反应转化淀粉所合成。由于野生CGT酶作用淀粉生产环糊精的环化活力较低，使得环糊精的工业生产成本较高。
[0004]本发明中所使用的来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans) STBOl的β-CGT酶总的环化活力约为302U/mg，因此，进一步提高该酶的环化活力，将更加有利于环糊精的
工业化生产。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的第一个技术问题是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的CGT酶的第577位的天冬氨酸(Asp)分别突变为丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)。所得5种突变体分别命名为:D577A、D577G、D577E、D577R 和 D577K。
[0006]编码所述CGT酶的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans) STBOl。所述 CGT 酶的氨基酸序列如 SEQ ID N0.2 所不。
[0007]本发明要解决的第二个技术问题是提供一种获得所述突变体D577A、D577G、D577E、D577R和D577K的方法。根据B.circulans STBOICGT酶的基因序列，分别设计并合成引入Ala577、Gly577、Glu577、Arg577和Lys577密码子突变的引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出编码D577A、D577G、D577E、D577R和D577K突变体的基因，并在枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。
[0008]所述方法包括以下步骤:
[0009](I)利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体cgt/pST为模板进行定点突变，所用引物分别是:
[0010]引入Asp577Ala突变的引物:
[0011]正向引物:5’ -GCAATGTGTATGCTAACTTCGAG-3 ’，下划线为突变碱基，
[0012]反向引物:5’ -CTCGAAGTTAGCATACACATTGC-3，，下划线为突变碱基；
[0013]引入Asp577Gly突变的引物:
[0014]正向引物:5’ -GCAATGTGTATGGTAACTTCGAG-3，，下划线为突变碱基，[0015]反向引物:5’ -CTCGAAGTTACCATACACATTGC-3，，下划线为突变碱基；
[0016]引入Asp577Glu突变的引物:
[0017]正向引物:5’ -GCAATGTGTATGAAAACTTCGAG-3，，下划线为突变碱基，
[0018]反向引物:5’ -CTCGAAGTTTTCATACACATTGC-3，，下划线为突变碱基；
[0019]引入Asp577Arg突变的引物:
[0020]正向引物:5’ -GCAATGTGTATCGTAACTTCGAG-3，，下划线为突变碱基，
[0021 ]反向引物:5 ’ -CTCGAAGTTACGATACACATTGC-3 ’，下划线为突变碱基；
[0022]引入As p577Lys突变的引物:
[0023]正向引物:5’ -GCAATGTGTATAAGAACTTCGAG-3，，下划线为突变碱基，
[0024]反向引物:5’ -CTCGAAGTTCTTATACACATTGC-3，，下划线为突变碱基。
[0025]PCR 反应体系均为 AXPrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10 μ L，dNTPs (各2.5πιΜ)4μ L，正向引物(10 μ Μ) I μ L，反向引物(10 μ Μ) I μ L,模板 DNAl μ L，PrimeSTAR HSDNA Polymerase (2.5U/ μ L) 0.5 μ L,加入双蒸水 32.5 μ L。
[0026]PCR反应扩增条件均为:PCR扩增条件均为:98°C预变性4min ;随后98 °C 10s，55°C 15s，72°C 8min 进行 35 个循环；最后 72°C保温 lOmin。
[0027]将PCR产物经过DpnI消化2h后，转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将含编码CGT酶突变体的基因的表达载体转入表达宿主B.subtilis WB600感受态细胞中。上述各培养基中均添加5 μ g/mL硫酸卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
[0028](2)突变体的表达与纯化
[0029]挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于LB培养基中，在37°C、200r/min下培养8~12h，以4% (v/v)接种量接种到TB培养基中，在37°C、200r/min下发酵48h。将发酵液于4°C、1000Orpm离心20min以除去菌体，收集上清液采用疏水PhenylHP柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法，分别纯化得到突变体D577A、D577G、D577E、D577R和D577K酶制品。各培养基中添加5 μ g/mL卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
[0030]本发明的有益效果:构建了 5个有意义的突变体D577A、D577G、D577E、D577R和D577K，均实现了重组CGT酶环化活力的提高，比野生型CGT酶更利于环糊精的工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1野生型CGT酶及其突变体在pH6.5、50°C下作用于10% (湿基，w/v)麦芽糊精生产环糊精情况；A，野生CGT酶；B，突变体D577A ；C,突变体D577G ；D,突变体D577E ；E,突变体D577R;F，突变体D577K;.，α-环糊精；.，β-环糊精；▲，Y -环糊精。
【具体实施方式】
[0032]实施例1突变位点的确定
[0033]钙离子结合位点广泛存在于α-淀粉酶家族中，作为α-淀粉酶家族(家族13)的一员，CGT酶也具有相似的钙离子结合位点。通过序列比对和晶体结构分析发现，钙离子结合位点Ca III在不同来源的CGT酶中存在显著差异，这暗示了该位点氨基酸残基的改变可能会对酶的活性产生影响。来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans) STBOl的CGT酶的钙离子结合位点由Ala315和Asp577两个氨基酸残基组成。
[0034]实施例2 突变体 D577A、D577G、D577E、D577R 和 D577K 的制备
[0035](I)定点突变
[0036]根据SEQ ID N0.1所示的野生CGT酶基因序列，分别设计并合成引入Ala577、Gly577、Glu577、Arg577和Lys577密码子突变的引物。
[0037]利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体cgt/pST为模板进行定点突变。
[0038]引入Ala577密码子的定点突变引物:
[0039]正向引物:5’ -GCAATGTGTATGCTAACTTCGAG-3，，下划线为突变碱基，
[0040]反向引物:5’ -CTCGAAGTTAGCATACACATTGC-3，，下划线为突变碱基；
[0041]引入Gly577密码子的定点突变引物:
[0042]正向引物:5’ -GCAATGTGTATGGTAACTTCGAG-3，，下划线为突变碱基，
[0043]反向引物:5’ -CTCGAAGTTACCATACACATTGC-3 ’，下划线为突变碱基；
[0044]引入Glu577密码子的定点突变引物:
[0045]正向引物:5’ -GCAATGTGTATGAAAACTTCGAG-3，，下划线为突变碱基，
[0046]反向引物:5’ -CTCGAAGTTTTCATACACATTGC-3，，下划线为突变碱基；
[0047]引入Arg577密码子的定点突变引物:
[0048]正向引物:5’ -GCAATGTGTATCGTAACTTCGAG-3，，下划线为突变碱基，
[0049]反向引物:5’ -CTCGAAGTTACGATACACATTGC-3，，下划线为突变碱基；
[0050]引入Lys577密码子的定点突变引物:
[0051 ]正向引物:5 ’ -GCAATGTGTATAAGAACTTCGAG-3，，下划线为突变碱基，
[0052]反向引物:5’ -CTCGAAGTTCTTATACACATTGC-3，，下划线为突变碱基。
[0053]PCR 反应体系均为:5 XPrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus) 10 μ L，dNTPs (各2.5πιΜ)4μ L，正向引物(10 μ Μ) I μ L，反向引物(10 μ Μ) I μ L,模板 DNAl μ L，PrimeSTAR HSDNA Polymerase (2.5U/ μ L) 0.5 μ L,加入双蒸水 32.5 μ L。
[0054]PCR反应扩增条件均为:PCR扩增条件均为:98°C预变性4min ;随后98 °C 10s，55°C 15s，72°C 8min 进行 35 个循环；最后 72°C保温 lOmin。
[0055]将PCR产物经过DpnI消化2h后,转入大肠杆菌(Escherichia coli) JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将含编码突变体的基因的突变质粒cgt/pST转入表达宿主B.subtilis WB6 00感受态细胞中。各培养基中均添加5 μ g/mL硫酸卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
[0056](2)突变体的表达和纯化
[0057]挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于50mL LB培养基的三角瓶中，在37°C、200r/min下培养8~12h，以4% (v/v)接种量接种到TB培养基中，在37°C、200r/min下发酵48h。各培养基中添加5 μ g/mL卡那霉素和10yg/mL赤霉素。将发酵液于4°C、1000Orpm下离心20min以除去菌体,收集上清液。
[0058]将发酵上清液采用疏水Phenyl HP柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法进行亲和纯化，得到第577位Asp分别突变为Ala、Gly、Glu、Arg及Lys的CGT酶，这些突变体酶分别命名为 D577A、D577G、D577E、D577R 和 D577K。
[0059]实施例3酶活测定分析
[0060](I)酶活力的测定
[0061]α -环化活力的测定:取适当稀释的酶液0.1mL,加入装有0.9mL预先用IOmM磷酸缓冲液(PH6.5)配制的1% (w/v)麦芽糊精(DE = 5)溶液的试管中，在50°C下反应10min后，加入1.0mLl.0N的盐酸停止反应，再加入1.0mL用IOmM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙溶液20°C下保温15min，在505nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白，对应α-环糊精标准曲线的测定出α -环糊精的含量。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成I μ mol的环糊精所需的酶量。
[0062]β -环化活力的测定:取适当稀释的酶液0.1mL,加入装有0.9mL预先用IOmM磷酸缓冲液(PH6.5)配制的1% (w/v)麦芽糊精(DE = 5)溶液的试管中，在50°C下反应10min后，加入3.5mL30mM NaOH和0.5mL由5mM Na2CO3溶液配制的0.02% (w/v)酚酞溶液反应，在室温下保温15min，在550nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成I μ mol β -环糊精所需的酶量。
[0063]Y-环化活力的测定:取适当稀释的酶液0.1mL,加入装有0.9mL预先用IOmM磷酸缓冲液(PH6.5)配制的1% (w/v)麦芽糊精(DE = 5)溶液的试管中，在50°C下反应10min后，加入50 μ L1.0N的盐酸停止反应，再加入2mL0.2M柠檬酸缓冲液(pH4.2)和100 μ L5mM溴甲酹绿溶液，在室 温下保温15min,在615nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成I μ mol Y -环糊精所需的酶量。
[0064]CGT酶的总环化活力即为上述三种环化活力之和。
[0065](2)酶活力比较
[0066]实验结果列于表1，结果发现，与野生CGT酶相比，突变体D577A的总环化活力提高了 5.9% ;突变体D577G的总环化活力提高了 8.7% ;突变体D577E总环化活力提高了14.0% ;突变体D577R总环化活力提高了 32.5% ;突变体D577K总环化活力提高了 1.3%。突变体D577A、D577⑶577E、D577R和D577K的产物特异性基本保持不变，β -环化活力占总环化活力的比例也没有发生明显改变。
[0067]表1
【权利要求】
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第577位的天冬氨酸分别突变为丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸或赖氨酸。
2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述核苷酸序列的载体或细胞。
4.一种获得权利 要求1所述突变体的方法，根据SEQ ID N0.1所示的基因序列，分别设计并合成定点突变引物，对基因进行定点突变，获得编码D577A、D577G、D577E、D577R和D577K突变体的基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述定点突变引物分别是: 引入Asp577Ala突变的引物:正向引物:5’-GCAATGTGTATGCTAACTTCGAG-3’，反向引物:5’ -CTCGAAGTTAGCATACACATTGC-3’ ； 引入Asp577Gly突变的引物:正向引物:5’-GCAATGTGTATGGTAACTTCGAG-3’，反向引物:5’ -CTCGAAGTTACCATACACATTGC-3’ ； 引入Asp577Glu突变的引物:正向引物:5’-GCAATGTGTATGAAAACTTCGAG-3’，反向引物:5’ -CTCGAAGTTTTCATACACATTGC-3’ ； 引入Asp577Arg突变的引物:正向引物:5’-GCAATGTGTATCGTAACTTCGAG-3’，反向引物:5’ -CTCGAAGTTACGATACACATTGC-3’ ； 引入Asp577Lys突变的引物:正向引物:5’-GCAATGTGTATAAGAACTTCGAG-3’，反向引物:5’ -CTCGAAGTTCTTATACACATTGC-3’。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilisffB600的单克隆于含5μ g/mL卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素的LB培养基中，在37°C、200r/min下培养8~12h，以体积比4%的接种量接种到含5 μ g/mL卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素的TB培养基中，在37°C、200r/min下发酵48h ;将发酵液于4°C、1000Orpm离心20min以除去菌体，收集上清液并纯化，分别得到突变体D577A、D577G、D577E、D577R和D577K。
7.一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化能力的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的CGTase的第577位天冬氨酸分别突变为丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸或赖氨酸。
8.权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在环糊精生产中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK103966180SQ201410169754
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】李兆丰, 顾正彪, 黄敏, 李才明, 洪雁, 程力 申请人:江南大学