检测巴贾病毒的实时荧光定量rt-pcr试剂盒和方法

检测巴贾病毒的实时荧光定量rt-pcr试剂盒和方法
【专利摘要】本发明涉及检测巴贾病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒和方法，检测巴贾病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒中包括2×RT-PCR?Buffer，25×RT-PCRenzymeMix，上下游引物，探针，所用引物和探针的核酸序列如SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2和SEQ?ID?No.3所示；阴性对照，阳性对照。本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒使用方便，试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，减少了在操作过程的污染，检测特异性强，灵敏度高，适用于快速检测巴贾病毒。
【专利说明】检测巴贾病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒和方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种用于检测巴贾病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂盒和方法。
【背景技术】
[0002]巴贾病毒(Bhanja Virus)属于布尼亚病毒科巴贾病毒组成员，最近被分到白蛉病毒属中。该病毒于1954年在印度的蜱中被分离到，主要分布于亚洲、非洲和欧洲等地。人和家畜可被携带有该病毒的蜱虫叮咬而感染，出现中枢神经系统症状，不但造成人类疾病和死亡，更会造成家畜死亡，导致经济损失，引起公共卫生问题。
[0003]目前，巴贾病毒检测的金标准是病毒分离，但因其操作繁琐、技术难度大、耗时长、实验条件要求高、在实际工作中难以推广应用。近年来应用广泛的常规核酸扩增及实时荧光定量PCR在病毒的检测方面发挥了重要作用。但是，鉴于蜱虫样本中病原载量较低等原因，建立一种快速、灵敏的检测技术，更利于蜱中载量较低的病毒检测。

【发明内容】

[0004]为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一组用于检测巴贾病毒的核酸序列。本发明利用TaqMan探针实时荧光PCR技术，建立一种快速、敏感的检测方法，应用于巴贾病毒的监测检测。
[0005]本发明还提供一种用于检测巴贾病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒及其检测方法。
[0006]本发明采用以下技术方案:
[0007]一种用于RT-PCR检测巴贾病毒的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ IDN0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
[0008]一组用于检测巴贾病毒的实时荧光定量RT-PCR核酸，该组核酸包括引物对、探针和作为阳性对照的扩增产物，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述作为阳性对照为包含有如SEQ IDN0.4所示的核苷酸序列。
[0009]一种检测巴贾病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，该试剂盒包括:
[0010]2 X RT-PCR buffer ；
[0011 ] 25 X RT-PCRenzymeMix ；
[0012]上游引物:核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0013]下游引物:核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；
[0014]探针:核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述探针5丨端连接荧光基团，3丨端连接淬灭基团；
[0015]阴性对照:无核酸酶灭菌超纯水；
[0016]阳性对照:包含有核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示的基因。[0017]如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光基团为FAM、CY3中任一一种，所述淬灭基团为 BHQl、TAMARA、BHQ2 中任——种。
[0018]一种TaqMan探针实时荧光RT-PCR方法检测巴贾病毒的非诊断性方法，该方法包括以下步骤:
[0019](I)从样品中提取病毒RNA ;
[0020](2)对提取的RNA进行实时荧光RT-PCR扩增，其中，反应体系按如下配制:I X RT-PCR Buffer, IXRT-PCR Enzyme Mix，上游引物:核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 所示；下游引物:核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；探针:核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述探针5'端连接荧光基团，3'端连接淬灭基团；上下游引物和探针浓度为0.01~I μΜ，样品RNA ;同时设置无核酸酶灭菌超纯水为阴性对照；
[0021 ] 实时荧光RT-PCR反应程序:
[0022]
【权利要求】
1.一种用于RT-PCR检测巴贾病毒的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
2.一组用于检测巴贾病毒的实时荧光定量RT-PCR核酸，其特征在于，该组核酸包括引物对、探针和作为阳性对照的扩增产物，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述作为阳性对照为包含有如SEQID N0.4所示的核苷酸序列。
3.—种检测巴贾病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括:
2XRT-PCR buffer ；
25 X RT-PCRenzymeMix ； 上游引物:核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示； 下游引物:核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示； 探针:核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述探针5丨端连接荧光基团，3丨端连接淬灭基团； 阴性对照:无核酸酶灭菌超纯水； 阳性对照:包含有核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示的基因。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为FAM、CY3中任一一种，所述淬灭基团为BHQl、TAMARA、BHQ2中任——种。
5.—种TaqMan探针实时荧光RT-PCR方法检测巴贾病毒的非诊断性方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)从样品中提取病毒RNA； (2)对提取的RNA进行实时荧光RT-PCR扩增，其中，反应体系按如下配制:1XRT_PCRBuffer, I X RT-PCR Enzyme Mix，上游引物:核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；下游引物:核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；探针:核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示,所述探针5 '端连接荧光基团，3 ’端连接淬灭基团；上下游引物和探针浓度为0.01~I μΜ，样品RNA;同时设置无核酸酶灭菌超纯水为阴性对照； 实时荧光RT-PCR反应程序:
【文档编号】C12Q1/68GK103937910SQ201410176174
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】刘丽娟, 陈倩, 王福祥, 侯咏, 刘玮, 张胜, 李颖 申请人:中国检验检疫科学研究院