一种口服猪生长激素融合蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种口服猪生长激素融合蛋白及其应用。所述口服猪生长激素融合蛋白由猪生长激素和Tat?PTD序列融合而成，所述Tat?PTD序列连接在猪生长激素的N端。本发明的口服猪生长激素融合蛋白能够很好地克服胃肠道蛋白酶屏障和黏膜物理屏障进入动物血液。利用该口服猪生长激素融合蛋白制备的饲料添加剂，能够显著改善断奶仔猪和育肥猪的日增重量和料肉比指标，提高生产率。
【专利说明】一种口服猪生长激素融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种口服猪生长激素融合蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002]我国是一个以食用猪肉为主的养猪大国，存栏数达5亿头，猪肉产量占世界的55%以上。由于消费人群庞大，猪肉品质安全至关重要。生猪“瘦肉精”的残留已在我们造成多起中毒事件，因此寻找更为安全的生长调节剂具有重要意义。
[0003]猪生长激素(pig growth hormone,简称pGH)是由猪脑垂体合成并分泌的一种蛋白类激素，具有调节代谢、促进生长的功能。PGH能够提高猪生长速度15-20%，增加胴体瘦肉率10%，效益极其显著(王索柱，养殖技术顾，2012-4:248)。最重要的是，pGH作为一种蛋白质类激素，与曾被广泛用作饲料添加剂的各种抗生素、类固醇类激素、人工合成的生长调节物质(如瘦肉精)不同 ，猪生长激素在促进猪生长发育的同时，不会在动物体内残留，使猪肉产品更为安全，不会威胁人类的健康。
[0004]我国重组猪生长激素的研制，上个世纪90年代初已经取得突破(余旭平等，生物工程学报，1991，7:307)，但迄今实际应用的规模非常之小。其原因在于，重组猪生长激素，需要每日注射，不仅操作困难，成本费用也相当不菲。虽然有猪生长激素脂质体的研究报导，但其长效缓释效果没有大幅度提高，仍难以实际应用(方希修等，山东饲料，2005-3:30)。在此背景下，研制开发出可供口服吸收的猪生长激素，意义重大。
[0005]而蛋白口服吸收(穿肠吸收)存在障碍，包括胃肠道蛋白酶屏障和黏膜物理屏障。口服蛋白首先要抵御胃肠道蛋白酶的降解，然后透过小肠粘膜进入血液，才能发挥作用。数十年来，为解决蛋白口服吸收的难题，有关专家倾注了大量精力，却一直无法有效突破，极大地限制了蛋白类药物的临床应用，也限制了一些功能蛋白直接作为饲料添加剂的应用，如动物生长激素和抗菌肽等。
[0006]Tat PTD是一个存在于HIV Tat蛋白内部、富含碱性氨基酸残基的结构域(YGRKKRRQRRR)，不仅具有广谱的蛋白转导作用，而且转导速度快、效率高、温度适应性广；所引导的蛋白质可以具有很大的分子量且不增加其免疫原性(Schwzrez SR., etal.，Science, 1999，285:1569)。目前对其作用机制尚不清楚，但不同于一般的经受体、通道或内吞作用的入胞方式(Foged, C.et al., Expert Opin.Drug Deliv.2008，5:105)。
[0007]由于蛋白口服吸收存在的障碍远远大于单纯的跨膜(细胞膜)递送，因此，TatPTD序列虽然具有非凡的跨膜递送功能，但该序列能否带领所引导的蛋白穿肠吸收，目前为止还未见报道。
【发明内容】
[0008]本发明提供了一种口服猪生长激素融合蛋白，该融合蛋白能被口服吸收。
[0009]一种口服猪生长激素融合蛋白，由猪生长激素和Tat PTD序列融合而成，所述TatPTD序列连接在猪生长激素的N端。
[0010]本发明中，所述猪生长激素是pGH全长序列(GenBank号为:ACH99977.1)中第36-214位、共179个氨基酸长度的成熟肽段。考虑到该成熟肽段的C末端具有半胱氨酸残基(Cys)，是参与二级结构形成的重要残基，故而确定将Tat PTD序列置于pGH的N端；为实现在原核细胞和酵母细胞胞内的表达，在Tat PTD之前再加上起始甲硫氨酸(Met)。最终设计的口服猪生长激素融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，共191个氨基酸，分子量22kd，其中，第一位为Met，第2-12位为Tat PTD序列(YGRKKRRQRRR)，第13-191位为猪生长激素成熟肽段序列。
[0011]对比试验也证实，当把Tat PTD序列置于pGH成熟肽段的C端时，融合蛋白的表达和提取复性效果均不理想。
[0012]本发明还提供了编码所述口服猪生长激素融合蛋白的基因。
[0013]为了实现所述口服猪生长激素融合蛋白在原核细胞和酵母细胞中的高效表达，依据SEQ ID N0.1所所示的氨基酸序列，进行了密码子优化，设计并合成了两种编码基因，其碱基序列分别如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示，分别用于大肠杆菌和毕赤酵母的表达。[0014]本发明还提供了含有基因的重组工程菌。
[0015]相应地，本发明提供了两种重组工程菌，其中重组工程菌A的宿主细胞为大肠杆菌，所导入的基因的碱基序列如SEQ ID N0.2所示。重组工程菌B的宿主细胞为酵母菌，所导入的基因的碱基序列如SEQ ID N0.3所示。
[0016]本发明还提供了一种饲料添加剂的制备方法，包括:
[0017](I)将重组工程菌A活化后接种至大肠杆菌发酵培养液中，发酵至0D_为3.0以上后加入IPTG诱导表达；
[0018]将重组工程菌A活化后按2%比例接种至20L大肠杆菌发酵培养液(如M9培养液)中，37°C发酵至OD6c?为3.0以上后加入IPTG诱导表达4h，诱导表达开始的同时开始补料，4h内补料4L。
[0019](2)收集菌体，破菌后离心收集包涵体，包涵体经洗涤、变性、复性纯化后，获得口服猪生长激素融合蛋白原液；
[0020]菌体被破碎后，脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白仍与包涵体粘连在一起，因此在溶解包涵体(变性)之前先洗涤包涵体。
[0021]变性时可选用8M的尿素作变性剂，待包涵体被全部溶解后，加入19倍体积的20mMTris-HCl (pH8.0)稀释复性，在pH8.0下经“阴离子交换-阳离子交换”串联层析，阳离子柱用2x PBS(pH7.5)洗脱，获得口服猪生长激素融合蛋白原液。
[0022]本发明选择的原核表达方式为包涵体表达，不仅因为包涵体表达量高，还因为pGH含两对二硫键，结构相对简单，不会出现错配，加之TatPTD序列呈强碱性，复性并不复杂，其后的纯化和去细菌内毒素简单许多。其后的实验结果也表明，在合适的发酵条件下，口服猪生长激素融合蛋白的表达量可占全菌蛋白的30 %，复性纯化后每升发酵液能获得纯度95%的重组蛋白I克以上，细菌内毒素含量小于10IU/mg。
[0023]并且，当利用大肠杆菌表达的口服猪生长激素融合蛋白(PBS稀释至lmg/ml)对SD大鼠进行穿肠活性试验时，发现口服后0.5至4小时大鼠血清中都检测到明显的ELISA信号，且在两个小时达到峰值浓度^9ng/mL)，表明本发明的口服猪生长激素融合蛋白能够有效地被动物穿肠吸收。
[0024](3)向所述口服猪生长激素融合蛋白原液中加入玉米淀粉，混匀后常温风干，获得所述饲料添加剂；
[0025]用PBS(pH7.5)将所述口服猪生长激素融合蛋白原液稀释至0.12mg/mL,向每毫升原液稀释液中加入Ig玉米淀粉，充分混匀，室温下自然风干后粉碎，过40目筛，即获得饲料添加剂pGHTJ-Ι。每克饲料添加剂pGHTJ-Ι含口服猪生长激素融合蛋白0.1mgo
[0026]或者，包括:
[0027](I)将重组工程菌B经活化后接种至酵母发酵培养液中，发酵后收集菌体；
[0028]所述酵母为毕赤酵母GSl 15，所述酵母发酵培养液可选用YPD培养基，发酵条件优选为28°C下发酵120h。
[0029](2)将菌体常温风干，和玉米淀粉混匀后获得所述饲料添加剂。
[0030]先将菌体常温风干至水分含量少于20%，然后将发酵菌体与玉米淀粉以1:500的重量比混合，即获得饲料添加剂pGHTJ-2。
[0031]经SDS-PAGE检测，口服猪生长激素融合蛋白的表达量占总蛋白含量的16%，而酵母菌中总蛋白含量可占其干物质总量的40%左右，大致估算每克风干菌体约含50mg所述口服猪生长激素融合蛋白，即每克饲料添加剂(PGHTJ-2)中约含0.1mg所述口服猪生长激素融合蛋白。
[0032]本发明还提供了所述制备方法制得的饲料添加剂以及所述饲料添加剂在制备猪饲料中的应用。所述应用包括:在猪基础日粮中添加I~8%的饲料添加剂，获得所述猪饲料。
[0033]试验发现，添加量为1-8%的饲料添加剂pGHTJ-Ι均能显著提高断奶仔猪的生产率，其中，2%的添加量能够使断奶仔猪的日增重提高27.3%，料肉比降低13.0%;继续增加添加量没有取得更好的促生长效果，故而饲料添加剂的添加量优选为2%。
[0034]试验发现，添加量为2%的饲料添加剂pGHTJ-Ι和pGHTJ-2均能显著改善育肥猪的日增重和料肉比，日增重分别增加33.3%和43.6%，均达极显著水平；料肉比分别下降
7.6%和8.3%，差异显著。
[0035]饲料添加剂pGHTJ-2的改善效果更为明显，这可能是因为酵母菌菌体经过肠胃道破碎降解后才释放出其中的口服猪生长激素融合蛋白，使得更多的口服猪生长激素融合蛋白能够到达小肠，继而被穿肠吸收。
[0036]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0037]本发明在猪生长激素成熟肽段的N端连接Tat PTD序列，获得的口服猪生长激素融合蛋白能够很好地克服胃肠道蛋白酶屏障和黏膜物理屏障进入动物血液。利用该口服猪生长激素融合蛋白作为饲料添加剂，能够显著改善断奶仔猪和育肥猪的日增重量和料肉比指标，提闻生广率。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1为口服猪生长激素融合蛋白在大肠杆菌(E.coli BL21/pET22b-Tat PTD-pGH)中的表达和纯化结果图；其中，I表示E.coli BL21/pET22b-Tat PTD-pGH诱导前，2表示E.coli BL21/pET22b-Tat PTD-pGH诱导后，3表示Tat PTD-pGH纯化后样品，4表示分子量标记(自上至下分别为 250、130、100、70、55、40、35、25、15kd)；
[0039]图2A为大鼠口服猪生长激素融合蛋白后血清中融合蛋白含量的ELISA测定结果；其中，I和2为标准曲线重复(自上而下浓度依次为125，62.5，31.25，16.1, 7.9，3.9，2，Ing/ml) ;3和4为样品和对照重复(自上而下依次为空白对照，阴性对照，Ohr血清，Ihr血清，2小时血清，4小时血清，阴性对照，空白对照；血清样品为PBS十倍稀释)；
[0040]图2B为大鼠口服猪生长激素融合蛋白后血清中融合蛋白含量的ELISA测定标准曲线；
[0041]图2C为大鼠口服猪生长激素融合蛋白后血清中融合蛋白的浓度；
[0042]图3为口服猪生长激素融合蛋白在毕赤酵母(Pichia pastoris GS115/pGAP_TatPTD-pGH)中的表达:其中，I表示分子量标记(自上至下分别为250、130、100、70、55、40、35、25、15kd) ;2 表不 Pichia pastoris GS115 ;3 表不 Pichia pastoris GS115/pGAP_TatPTD-pGH 摇瓶表达；4 表示 Pichia pastoris GS115/pGAP_Tat PTD-pGH 发酵罐中表达。
【具体实施方式】
[0043]下面结合附图和 【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0044]下述实施例中，所采用的分子生物学技术，如无特殊说明，均为常规方法，为业内人士所公知，或可参见萨姆布鲁克拉塞尔所著的《分子克隆实验指南》(黄培堂译，科学出版社，2002 年)。
[0045]实施例1利用大肠杆菌制备口服猪生长激素融合蛋白
[0046]根据Tat PTD序列及猪生长激素成熟肽氨基酸序列，设计口服猪生长激素融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID N0.1)。根据SEQ ID N0.1序列并考虑大肠杆菌的密码子偏好性设计碱基序列SEQ ID N0.2。在SEQ ID N0.2前后分别设计NdeI与EcoRI酶切位点，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成。
[0047]合成的全基因序列经NdeI与EcoRI酶切并回收酶切片段，与同样酶切并回收的pET22b质粒载体片段连接。连接产物通过氯化钙法转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子并测序鉴定。
[0048]将测序正确的表达质粒pET22b-Tat_pGH通过氯化钙法转化大肠杆菌BL21感受态细胞，用含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子，获得表达菌株E.coliBL21/pET22b-Tat-pGH。
[0049]将表达菌株E.coli BL21/pET22b-Tat_pGH接种至含100μ g/mL氨苄青霉素的400ml LB培养基，于37°C、200rpm摇床过夜培养。次日按2%比例转接至20L含100 μ g/mL氨苄青霉素的M9培养基的发酵罐中，维持37°C、pH7.0、溶氧(DO) 40%培养至0D_达3.0，加入异丙基_β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5mM进行诱导表达4h，诱导开始的同时开始补料，4小时内补料4L。
[0050]发酵结束后离心收集菌体并称重，使用高压均质机充分破菌(聚能生物JN-3000PLUS, 30C，140Mpa)，离心收集包涵体。
[0051 ] 包涵体使用8M尿素溶解(20mL/g包涵体)，离心去除不溶物后缓慢加入19倍体积的20mM Tris-Cl (pH8.0)。复性溶液在pH8.0条件下经“阴离子交换-阳离子交换”串联层析，阳离子柱用2XPBS洗脱，得口服猪生长激素融合蛋白原液(图1)，浓度在10mg/ml以上，纯95%，内毒素低于10EU/mg。
[0052]实施例2 口服猪生长激素融合蛋白口服穿肠活性试验
[0053]实验动物为SD大鼠(购自安徽医科大学实验动物中心)，雄性，3只，体重200克左右。试验开始前，动物禁食不禁水12小时。取实施例1所制备的口服猪生长激素融合蛋白原液，PBS稀释至lmg/ml，每只动物灌胃给予Img猪生长激素融合蛋白。分别于试验开始前(O小时)和灌胃后0.5、1、2、3、4小时眼眶取血500微升，冰浴静止I小时，4000rpm离心分离血清，冻存于负70°C下。
[0054]按Cusabio kit (CSB_E06813p)说明书操作，测定大鼠血清中口服猪生长激素融合蛋白的含量。实验结果如图2A、图2B、图2C所示。可见SD大鼠口服猪生长激素融合蛋白后0.5小时血液中开始出现阳性信号，至2小时达到峰值浓度(69ng/mL)，4小时已经开始下降。由于没有做出最够的时间点，不能够用峰下面积拟合计算总吸收量。
[0055]实施例3利用毕赤酵母制备口服猪生长激素融合蛋白
[0056]根据SEQ ID N0.1的氨基酸序列和毕赤酵母密码子偏好性设计了 SEQ ID N0.3所示的碱基序列，在SEQ ID N0.3序列前后分别添加EcoRI与XhoI酶切位点，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成。
[0057]合成的全基 因序列经EcoRI与XhoI酶切并回收酶切片段，与同样酶切并回收的pGAPZ质粒载体片段连接。连接产物通过氯化钙法转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB抗性平板筛选阳性转化子，并测序鉴定。大量提取测序正确的阳性转化子质粒pGAPZ-Tat-pGH，经BspHI线性化后电击转化毕赤酵母GSl 15，筛选获得高表达菌株 P.pGS115/pGAPZ-Tat-pGH。
[0058]将P.pGS115/pPIC3.5K_Tat-pGH活化后接种在含24升YPD培养基的30L发酵罐中，于28°C发酵120小时，收获菌体并常温风干至水分含量20%以下。
[0059]经SDS-PAGE检测，酵母菌中总蛋白含量可占其干物质总量的40%左右，口服猪生长激素融合蛋白的表达量为总蛋白含量的16%，大致估算每克干菌体约含口服猪生长激素融合蛋白50mg。
[0060]实施例4利用口服猪生长激素融合蛋白制备饲料添加剂
[0061](I)用大肠杆菌表达的口服猪生长激素融合蛋白制备饲料添加剂
[0062]取实施例1制备的口服猪生长激素融合蛋白原液，用PBS稀释至0.12mg/ml，每毫升原液稀释液中加入I克玉米淀粉(食品级，河南金润食品添加剂有限公司)，充分混匀，室温下自然风干后粉碎，过40目筛，密封包装后低温(2-8°C)干燥处存放，可直接作为饲料添加剂使用，编号标注为pGHTJ-Ι。
[0063]所制备的pGHTJ-1，干燥失重法测定其水分含量为15%以下，每克pGHTJ-Ι中约含口服猪生长激素融合蛋白0.1mg0
[0064]所制备的pGHTJ-1，2-8 V干燥处存放，分别在存放后1、3、6、12个月时，随即从3个包装中取样进行稳定性试验:干燥失重法测定水分含量，Bradford法检测其蛋白含量(碧云天公司试剂盒)，SDS-PAGE法检测其纯度，结果如表1所示。
[0065]表1pGHTJ-1 稳定性试验(χ士sd，n=3 )
[0066]
【权利要求】
1.一种口服猪生长激素融合蛋白，其特征在于，由猪生长激素和TatPTD序列融合而成，所述Tat PTD序列连接在猪生长激素的N端。
2.如权利要求1所述的口服猪生长激素融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDN0.1所示。
3.编码如权利要求1~2任一所述口服猪生长激素融合蛋白的基因。
4.含有如权利要求3所述基因的重组工程菌。
5.权利要求4述的重组工程菌，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌，所述基因的碱基序列如SEQ ID N0.2所示。
6.权利要求4述的重组工程菌，其特征在于，宿主细胞为酵母菌，所述基因的碱基序列如 SEQ ID N0.3 所示。
7.—种饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括: (1)将如权利要求5所述的重组工程菌活化后接种至大肠杆菌发酵培养液中，发酵至OD600为3.0以上后加入IPTG诱导表达； (2)收集菌体，破菌后离心收集包涵体,包涵体经洗涤、变性、复性纯化后,获得口服猪生长激素融合蛋白原液； (3)向所述口服猪生长激素融合蛋白原液中加入玉米淀粉，混匀后常温风干，获得所述饲料添加剂； 或者，包括: (1)将如权利要求6所述的重组工程菌经活化后接种至酵母发酵培养液中，发酵后收集菌体； (2)将所述菌体常温风干，和玉米淀粉混匀后获得所述饲料添加剂。
8.如权利要求7所述制备方法制得的饲料添加剂。
9.如权利要求8所述饲料添加剂在制备猪饲料中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，在猪基础日粮中添加I~8%的饲料添加剂，获得所述猪饲料。
【文档编号】C12N15/62GK103936864SQ201410188634
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】路遥, 桂向东, 李晓祥 申请人:安徽新星生物工程有限公司