牛支原体扩大培养专用培养基（mb-hls）及其制备方法
【专利摘要】牛支原体扩大培养专用培养基（MB-HLS）及其制备方法，其特征在于：无需加入20%的血清以及小牛胸腺DNA，用去脂肪、筋腱健康的牛心、肺组织，加入适量的胰蛋白酶、NaCl、MgSO4·7H2O、MgCl2·6H2O、Na2HPO4·2H2O、KH2PO4·2H2O、无水碳酸钠、2.8%CaCl2、水解乳蛋白、HCI、NaOH和酚红，蒸汽加热、搅拌、过滤、灭菌方法制成的培养基，培养72小时后牛支原体蛋白含量为1.61-1.83mg/ml。本发明具有成本低、菌体蛋白含量高的优点，为牛支原体疫苗的研发与大批量生产提供有力的技术支撑。
【专利说明】牛支原体扩大培养专用培养基(MB-HLS)及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物防疫领域，尤其是一种牛支原体扩大培养专用培养基(MB-HLS)及其制备方法。
【背景技术】
[0002]牛支原体(Mycoplasmabovis)是犊牛传染性肺炎与关节炎的主要病原体。该病属世界范围分布，欧洲每年约有25%~33%的犊牛肺炎是由支原体引起的，相当于每年损失
1.44亿~1.92亿欧元，其中英国每年有190万头患牛支原体肺炎，死亡达15.7万头，美国每年由于牛支原体导致的牛呼吸系统疾病和乳腺疾病所造成的损失达1.40亿美元，单个牛场最高感染率达70%[1]。我国自2008年以来，已有7个省区报道该疾病的发生，发病率为50~100%，病死率10~50%[2~5]。本课题组对新疆六个地区15个牛场调查表明，被检测牛场均有牛支原体感染，血清阳性率高达76.43%，从44份病死犊牛肺脏及关节液中分离鉴定出18株牛支原体[6]，进一步证实牛支原体已成为严重危害国内奶牛健康的重要病原体。
[0003]由牛支原体感染引起的犊牛传染性肺炎与关节炎属国内外近十年来新发动物传染病，由于犊牛发病后病程长，药物治疗效果较差，费用高，因此疫苗研制受到重点关注，但目前除美国外，几乎没有商品化疫苗应用于牛支原体感染的预防。美国虽有两种商业化全细胞疫苗，但未见公开发表的证据确实其有效性[7]。影响全细胞疫苗研制的限定因素是需要大量培养获得高浓度的支原体抗原。由于牛支原体对生长所需要的营养极为苛刻，生长缓慢，且多数菌株不发酵或弱发酵葡萄糖，难以检测生长状况；大量培养的技术难度较高，很大程度上限制了牛支原体疫苗的研发与应用。
[0004]目前国外报道及通用的牛支原体培养基存在的主要问题是:
培养基中需要添加10~20%的血清以及小牛胸腺D N A，这无疑增加了牛支原体大量培养的成本，影响了疫苗生产厂家的研发费用及疫苗应用单位的使用成本，这是长期以来支原体疫苗生产中未能解决的一项关键技术问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于,研究建立了一种无需加入10~20%的血清以及小牛胸腺D NA，从而，显著降低培养基成本，又能满足牛支原体良好生长的牛支原体扩大培养专用培养基，为牛支原体疫苗的研发与生产提供技术支撑。
[0006]本发明的牛支原体扩大培养专用培养基(MB-HLS)由下述配方组成:
一.基础部分1000ml的培养基中含:
去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:250~350g ；
1:250 ~1:300 胰蛋白酶(Trpsin):1 ~1.3g ;
NaCl:4 ~4.5g ;
KCl:0.1 ~0.3g ;MgS04.7H20:0.25 ~0.75g；
MgCl2.6H20:0.25 ~0.75g ；
Na2HP04.2H20:0.015 ~0.045g ；
KH2P04.2H20:0.015 ~0.045g ；
无水碳酸钠:3.5~5g ;
1.4 ~4.2%CaC12:1.25 ~1.75ml ；
水解乳蛋白:2.25~2.75g；
HCI:8 ~IOml ；
Imol 的 NaOH:
0.2 ~0.6% 酚红:1.6 ~2.0ml ；
去离子水:至 1000ml ；
二.添加剂部分 葡萄糖:5~15g ；
25~30%酵母酸浸汁:5~15ml ;
本发明的牛支原体扩大培养专用培养基(MB-HLS)，由下述制备方法获得:
取去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:250~350g ;加入去离子水300~600ml，蒸汽加热、搅拌，温度达到78~80°C时停止加热:
续加去离子水使培养基的总量达到1000ml，用40%的无水碳酸钠溶液调整pH为7.8~
8.2，冷却至50°C以下时，边搅拌边加入1:250~1:300胰蛋白酶(Trpsin) I~1.3g，置于35~50°C水浴中3~5小时，期间检测pH值并调整为7.8~8.2 ;
边搅拌边加入浓HCI，蒸汽浴50~70分钟；
过滤，冷至室温时，用ImolNaOH调整pH至7.8~8.2，110~120°C蒸汽加热5~IOmin ；
过滤，按配方依次加入 NaCl:4 ~4.5g ；KC1:0.1 ~0.3g ；MgS04.7Η20:0.25 ~0.75g ；MgCl2.6H20:0.25 ~0.75g ；Na2HP04.2H20:0.015 ~0.045g ；ΚΗ2Ρ04.2Η20:0.015 ~0.045g ;1.4 ~4.2%CaC12:1.25 ~1.75ml ;水解乳蛋白:2.25 ~2.75g ;葡萄糖:5 ~15g ；25~30%酵母酸浸汁:5~15ml ；0.2~0.6%酚红:1.6~2.0ml ;补充去离子水，使培养基的总量达到1000ml，用ImolNaOH调pH至8.0，用0.1~0.15 μ m滤膜过滤除菌，在I~5°C贮存备用。
[0007]本发明培养基的72小时培养物中的菌体蛋白含量为1.61-1.83mg/mlml，显著高于加入20%的血清以及小牛胸腺D N A的“葡萄糖血清肉汤”培养基(0.97mg/ml);高于“改良Thiaucourt’s培养基”(1.49mg/ml),高于牛心湯培养基(0.99mg/ml),本培养基的成本为37.5元/升，远远低于“葡萄糖血清肉汤”培养基545.5元/升，改良Thiaucourt’ s培养基”466.48元/升，牛心湯培养基232.2元/升。
[0008]本发明具有成本低、菌体蛋白含量高的优点，为牛支原体疫苗的研发与大批量生产提供有力的技术支撑。
【具体实施方式】
[0009]实施例1:本发明的 牛支原体扩大培养专用培养基(MB-HLS)由下述配方组成:
一.基础部分1000ml的培养基中含:
去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:250g ；
1:250 胰蛋白酶(Trpsin):1.3g ；
NaCl:4.2g ；
KCl:0.2g ；
MgS04.7H20:0.35g ；
MgCl2.6H20:0.6g ；
Na2HP04.2H20:0.035g ；
KH2P04.2H20:0.025g ；
无水碳酸钠:4g ；
2.5%CaC12:1.65ml ；
水解乳蛋白:2.6g ；
HCI:9ml ；
Imol 的 NaOH:
0.5% 酚红:1.7ml ；
去离子水:至1000ml ；
二.添加剂部分 葡萄糖:8g ；
25%酵母酸浸汁:6ml ；
本发明的牛支原体扩大培养专用培养基(MB-HLS)，由下述制备方法获得:
取去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:300g ;加入去离子水500ml，蒸汽加热、搅拌，温度达到80°C时停止加热；
续加去离子水使培养基的总量达到1000ml，用30%的无水碳酸钠溶液调整pH为8，冷却至50°C以下时，边搅拌边加入1:250胰蛋白酶(Trpsin) Ig,置于45°C水浴中5小时，期间检测pH值并调整为8 ；
边搅拌边加入浓HCI，蒸汽浴55分钟；
过滤，冷至室温时，用ImolNaOH调整pH至8.2，110°C蒸汽加热IOmin;
过滤，按配方依次加入 NaCl:4.4g ；KC1:0.15g ；MgS04.7H20:0.5g ；MgC12.6H20:0.5g ；Na2HP04.2H20:0.03g ；KH2P04.2H20:0.035g ；1.5%CaC12:1.5ml ;水解乳蛋白:
2.25g ;葡萄糖:15g ;30%酵母酸浸汁:15ml ；0.4%酚红:1.8ml ;补充去离子水，使培养基的总量达到1000ml，用ImolNaOH调pH至8.0，用0.1 μ m滤膜过滤除菌，在I~5°C贮存备用。
[0010]实施例2:
本发明的牛支原体扩大培养专用培养基(MB-HLS)由下述配方组成:
一.基础部分1000ml的培养基中含:
去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:300g ；
1:300 胰蛋白酶(Trpsin):lg ；
NaCl Ag ；
KCl:0.28g ；MgS04.7H20:0.45g ；
MgCl2.6H20:0.5g ；
Na2HP04.2H20:0.02g ；
KH2P04.2H20:0.018g ；
无水碳酸钠:3.5g ；
2.8%CaC12:1.25ml ；
水解乳蛋白:2g ；
HCI:8ml ；
Imol 的 NaOH:
0.2% 酚红:1.6ml ； 去离子水:至1000ml ；
二.添加剂部分 葡萄糖:7g ；
280%酵母酸浸汁:5ml ；
本发明的牛支原体扩大培养专用培养基(MB-HLS)，由下述制备方法获得:
取去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:260g ;加入去离子水400ml，蒸汽加热、搅拌，温度达到78°C时停止加热；
续加去离子水使培养基的总量达到1000ml，用35%的无水碳酸钠溶液调整pH为8，冷却至500C以下时，边搅拌边加入1:250胰蛋白酶(Trpsin) 1.3g，置于50°C水浴中3.5小时，期间检测pH值并调整为8 ；
边搅拌边加入浓HCI，蒸汽浴55分钟；
过滤，冷至室温时，用ImolNaOH调整pH至8，115°C蒸汽加热9min ；
过滤，按配方依次加入 NaCl:4.3g ；KC1:0.3g ；MgS04.7H20:0.4g ；MgC12.6H20:0.4g ；Na2HP04.2H20:0.031g ；KH2P04.2H20:0.03g ；1.4%CaC12:1.25ml ;水解乳蛋白:2.3g ;葡萄糖:10g ;25%酵母酸浸汁:10ml ；0.4%酚红:1.6ml ;补充去离子水，使培养基的总量达到1000ml，用ImolNaOH调pH至8.0，用0.12 μ m滤膜过滤除菌，在I~5°C贮存备用。
[0011]实施例3:
本发明的牛支原体扩大培养专用培养基(MB-HLS)由下述配方组成:
基础部分1000ml的培养基中含:
去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:260g ；
1:250 胰蛋白酶(Trpsin):1.1g;
NaCl:4.3g ；
KCl:0.3g ；
MgS04.7H20:0.75g ；
MgCl2.6H20:0.45g ；
Na2HP04.2H20:0.016g ；
KH2P04.2H20:0.017g ；
无水碳酸钠:3g ；
2.6%CaC12:1.4ml ；水解乳蛋白:2.4g ；
HCI:9.5ml ；
Imol 的 NaOH:
0.4% 酚红:1.5ml ；
去离子水:至1000ml ；
二.添加剂部分 葡萄糖=1Og ;
26%酵母酸浸汁:7ml ；
本发明的牛支原体扩大培养专用培养基(MB-HLS)，由下述制备方法获得:
取去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:260g ;加入去离子水350ml，蒸汽加热、搅拌，温度达到79°C时停止加热；
续加去离子水使培养基的总量达到1000ml，用40%的无水碳酸钠溶液调整pH为7.8，冷却至50°C以下时，边搅拌边加入1:250胰蛋白酶(Trpsin)l.lg，置于40°C水浴中4小时，期间检测PH值并调整为7:
边搅拌边加入浓HCI，蒸汽浴53分钟:
过滤，冷至室温时，用ImolNaOH调整pH至7，115°C蒸汽加热8min:
过滤，按配方依次加入 NaCl:4.5g ；KC1:0.2g ；MgS04.7H20:0.25g ；MgC12.6H20:
0.35g ；Na2HP04.2H20:0.033g ；KH2P04.2H20:0.25g ；2%CaC12:1.45ml ;水解乳蛋白:
2.4g ;葡萄糖:7g ;26%酵母酸浸汁:8ml ；0.3%酚红:1.9ml ;补充去离子水，使培养基的总量达到1000ml，用ImolNaOH调pH至8.0，用0.12 μ m滤膜过滤除菌，在I~5°C贮存备用。
[0012]实施例4:
本发明的牛支原体扩大培养专用培养基(MB-HLS)由下述配方组成:
一.基础部分1000ml的培养基中含:
去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:350g ；
1:250 胰蛋白酶(Trpsin):1.2g ；
NaCl:4.5g ；
KCl:0.27g ；
MgS04.7H20:0.7g ；
MgCl2.6H20:0.7g ；
Na2HP04.2H20:0.045g ；
KH2P04.2H20:0.045g ；
无水碳酸钠:5g ；
3.5%CaC12:1.75ml ；
水解乳蛋白:2.75g；
HCI:10ml ；
Imol 的 NaOH:
0.6% 酚红:2.0ml ；
去离子水:至1000ml ；
二.添加剂部分葡萄糖:15g ；
30%酵母酸浸汁:15ml ;
本发明的牛支原体扩大培养专用培养基(MB-HLS)，由下述制备方法获得:
取去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:350g ;加入去离子水450ml，蒸汽加热、搅拌，温度达到78°C时停止加热；
续加去离子水使培养基的总量达到1000ml，用40%的无水碳酸钠溶液调整pH为7.8，冷却至50°C以下时，边搅拌边加入1:250胰蛋白酶(Trpsin)l.2g，置于35~50°C水浴中
3.小时，期间检测pH值并调整为7.8 ；
边搅拌边加入浓HCI，蒸汽浴65分钟；
过滤，冷至室温时，用ImolNaOH调整pH至7.8，115°C高压蒸汽加热8min ；
过滤，按配方依次加入 NaCl:4g ；KC1:0.1g ；MgS04.7H20:75g ；MgC12.6H20:0.75g ；Na2HP04.2H20:0.045g ；KH2P04.2H20:0.045g ；3%CaC12:1.75ml ;水解乳蛋白:2.75g ;葡萄糖:15g ;28%酵母酸浸汁:12ml ；0.4%酚红:1.9ml ;补充去离子水，使培养基的总量达到1000ml，用ImolNaOH调pH至8.0，用0.14 μ m滤膜过滤除菌，在I~5°C贮存备用。
[0013] 实施例5:
本发明的牛支原体扩大培养专用培养基(MB-HLS)由下述配方组成:
一.基础部分1000ml的培养基中含:
去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:280g ；
1:250 胰蛋白酶(Trpsin):1.15g ；
NaCl:4.4g ；
KCl:0.1g ；
MgS04.7H20:0.3g ；
MgCl2.6H20:0.75g ；
Na2HP04.2H20:0.015g ；
KH2P04.2H20:0.02g ；
无水碳酸钠:4.5g ；
1.4%CaC12:1.35ml ；
水解乳蛋白:2.65g;
HCI:8.2ml ；
Imol 的 NaOH:
0.3% 酚红:1.8ml ；
去离子水:至1000ml ；
二.添加剂部分 葡萄糖=IOg ;
27%酵母酸浸汁:8ml ；
本发明的牛支原体扩大培养专用培养基(MB-HLS)，由下述制备方法获得:
取去脂肪、筋腱健康的的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:280g ;加入去离子水520ml，蒸汽加热、搅拌，温度达到80°C时停止加热；
续加去离子水使培养基的总量达到1000ml，用40%的无水碳酸钠溶液调整pH为8.2，冷却至50°C以下时，边搅拌边加入1:250胰蛋白酶(Trpsin) 1.15g，置于4°C水浴中5小时，期间检测PH值并调整为8.2 ；
边搅拌边加入浓HCI，蒸汽浴65分钟；
过滤，冷至室温时，用ImolNaOH调整pH至8.2，115°C高压蒸汽加热7min ；
过滤，按配方依次加入 NaCl:4.25g ；KC1:0.17g ；MgS04.7H20:0.35g ；MgC12.6H20:
0.4g ；Na2HP04.2H20:0.035g ；KH2P04.2H20:0.035g ；4%CaC12:1.52ml ;水解乳蛋白:
2.62g ;葡萄糖:8.5g ;26%酵母酸浸汁:6ml ；0.2%酚红:1.9ml ;补充去离子水，使培养基的总量达到1000 ml，用ImolNaOH调pH至8.0，用0.1 μ m滤膜过滤除菌，在I~5°C贮存备用。
【权利要求】
1.一种牛支原体扩大培养专用培养基，其特征在于:由下述配方组成: 一.基础部分1000ml的培养基中含: 去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:250~350g ； . 1:250~1:200胰蛋白酶1~1.3g ;
NaCl:4 ~4.5g ;
KCl:0.1 ~0.3g ;
MgS04.7H20:0.25 ~0.75g；
MgCl2.6H20:0.25 ~0.75g ；
Na2HP04.2H20:0.015 ~0.045g ；
KH2P04.2H20:0.015 ~0.045g ； 无水碳酸钠:3.5~5g ; . 1.4 ~4.2%CaC12:1.25 ~1.75ml ； 水解乳蛋白:2.25~2.75g；
HCI:8 ~IOml ；
Imol 的 NaOH: . 0.2 ~0.6% 酚红:1.6 ~2.0ml ； 去离子水:至1000ml ； 二.添加剂部分 葡萄糖:5~15g ； .25~30%酵母酸浸汁:5~15ml。
2.一种牛支原体扩大培养专用培养基，其特征在于:由下述制备方法获得: 取去脂肪、筋腱健康的牛心、肺或二者的任意比例的混合物:250~350g ;加入去离子水300~600ml，蒸汽加热、搅拌，温度达到78~80°C时停止加热； 续加去离子水使培养基的总量达到1000ml，用30~50%的无水碳酸钠溶液调整pH为7.8~8.2，冷却至50°C以下时，边搅拌边加入1:250~1:300胰蛋白酶I~1.3g，置于35~50°C水浴中3~5小时，期间检测pH值并调整为7.8~8.2 ; 边搅拌边加入浓HCI，蒸汽浴50~70分钟；过滤，冷至室温时，用NaOH调整pH至7.8~8.2，110~120°C蒸汽加热5~IOmin ；过滤，按配方依次加入 NaCl:4 ~4.5g ；KC1:0.1 ~0.3g ；MgS04.7Η20:0.25 ~0.75g ；MgCl2.6H20:0.25 ~0.75g ；Na2HP04.2H20:0.015 ~0.045g ；ΚΗ2Ρ04.2Η20:0.015 ~0.045g ;1.4 ~4.2%CaC12:1.25 ~1.75ml ;水解乳蛋白:2.25 ~2.75g ;葡萄糖:5 ~15g ；25~30%酵母酸浸汁:5~15ml ；0.2~0.6%酚红:1.6~2.0ml ;补充去离子水，使培养基的总量达到1000ml，用NaOH调pH至7.8~8.2用0.1~0.15 μ m滤膜过滤除菌，在I~5°C贮存备用。
【文档编号】C12R1/35GK103937728SQ201410188388
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年5月7日 优先权日:2014年5月7日
【发明者】剡根强, 王静梅, 杨铭伟 申请人:石河子大学