一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，本发明包括以下步骤：（1）鳕鱼皮预处理；（2）酶解反应：加入胰蛋白酶酶解反应；（3）超滤得GM2组分；（4）DEAE-SepharoseFF离子交换层析分离得到GM2-2组分；（5）SephadexG-25层析分离得GM2-2-3组分，冷冻干燥后得到肝病辅食型胶原蛋白肽。本发明以水产加工副产物鳕鱼皮为原料，从中提取具有肝细胞修复作用的胶原蛋白肽，简单易行，生产成本低，可以显著提高水产加工副产品的价值，避免浪费的同时还保护了环境，还能为开发相关功能性食品提供前期基础。
【专利说明】一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及海洋生物提取【技术领域】，特别涉及一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 鳕鱼皮由于其蛋白含量高，故其主要的生物活性成分即为活性肽。现在 研究发现，鳕鱼皮生物活性肽具有抗氧化、抗病毒、抗胃溃疡等作用。Dai-Hung Ngo等从太平洋鳕鱼皮中分离纯化两种胶原蛋白肽，Thr-Cys-Ser-Pro (388 Da)和 Thr-Gly-Gly-Gly-Asn-Val (485. 5 Da)。通过电子自旋共振法证明了纯化的肽的抗氧 化活性，同时也具有血管紧张素转换酶抑制作用，说明鳕鱼皮胶原蛋白肽具有抗氧化 和抗高血压的作用（Dai-Hung Ngoa, BoMiRyua, Thanh-SangVoa, etal. Free radical scavenging and angiotensin-I converting enzyme inhibitory peptidesfrom Pacific cod (Gadus macrocephalus) skin gelatin [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011，4(9) : 1110 - 1116)。宛宁从鳕鱼皮中分离的到一种胶原蛋白肽 PGEKGPSGEAGTAGPPGTPGPQGL，该肽能直接作用于病毒颗粒，病毒的凝集价显著降低且成剂 量依赖性，具有极强的流感病毒神经氨酸酶抑制活性，活性肽的抗病毒作用具有多靶点（苑 宁.鳕鱼皮中流感病毒神经氨酸酶抑制活性肽的研究[D].青岛：中国海洋大学，2013)。 王志聪等探究鳕鱼皮胶原蛋白肽的抗酒精性胃溃疡作用，采用酒精诱导大鼠急性胃溃疡模 型，试验组灌胃给予不同剂量的胶原肽，检测胃溃疡指数、胃溃疡抑制率并对胃溃疡病灶部 位进行组织学观察。结果与模型组相比，各受试物均能够降低大鼠胃腺的出血损伤，降低胃 溃疡指数，具有良好的抗酒精性胃溃疡作用（王志聪，孙京沙，倪鑫，等.鳕鱼皮胶原蛋白 肽的抗酒精性胃溃疡作用[J].中国海洋药物杂志，2012, 35(5) :17-22 )。
[0003]目前，胶原蛋白肽的保健功能主要在美容护肤、补钙健骨、止血免疫等方面，但是 现在还未有研究关于胶原蛋白肽对肝脏的损伤保护作用，而现有的肝脏损伤的保护主要依 靠各类药物，但是药物都存在一定的毒性和抗药性，生物活性肽是具有无毒、安全的特点， 是理想的辅助治疗材料，亟需开发一种对肝脏的损伤保护效果好的生物活性肽。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，以水产加 工副产物鳕鱼皮为原料，从中提取具有肝细胞修复作用的胶原蛋白肽，简单易行，生产成本 低，可以显著提高水产加工副产品的价值，避免浪费的同时还保护了环境，还能为开发相关 功能性食品提供如期基础。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤： (1)鳕鱼皮预处理：将鳕鱼皮洗净后用4°C纯水浸泡20-30min，后用浓度0. 1-0. 2mol/L NaOH浸泡6-8小时，用清水冲洗至pH=7,浙干水分后，用浓度0. 1-0. 2mol/L的冰醋酸溶胀 10-12小时，最后用剪刀剪碎； (2)酶解反应：将步骤（1)预处理后的鳕鱼皮与水按照1:4 (w/v)的料液比混合，然后 加入胰蛋白酶酶解反应； 采用胰蛋白酶酶解的产物对肝细胞的损伤修复效果最好。
[0006] (3)超滤：步骤（2)酶解反应结束后，灭酶，离心，收集上清液，上清液用超滤膜超 滤，截留获得分子量为5-10KDa的组分，冷冻干燥后得GM2组分；GM2组分对肝细胞的损伤 修复效果最好。
[0007] (4) DEAE-Sepharose FF 离子交换层析分离：将 GM2 组分上 DEAE-Sepharose FF 离 子交换柱，采用PH4. 5的醋酸-醋酸钠缓冲液作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后得 到GM2-2组分；GM2-2组分对肝细胞的损伤修复效果最好。
[0008] (5)3印1^(1616-25层析分离：将612-2组分经3印1^(1616-25凝胶柱洗脱后，从上 样开始计时，收集90-100min时间段洗脱液获得GM2-2-3组分，冷冻干燥后得到肝病辅食型 胶原蛋白肽。GM2-2-3组分对肝细胞的损伤修复效果最好。
[0009] 作为优选，步骤（2)酶解条件为：胰蛋白酶用量为每g鳕鱼皮加入2000U，酶解温度 50°C，pH 6,时间8h。这样的条件下酶解效果最好，所得产物对肝细胞的损伤修复效果最好。
[0010] 作为优选，步骤（4)中DEAE-S印harose FF离子交换柱的洗脱条件具体为：GM2组 分加超纯水配制成200mg/ml的溶液上样，每次上样量为2ml，洗脱速度为lml/min。
[0011] 作为优选，步骤（5)中Sephadex G-25凝胶柱的洗脱条件具体为： 柱尺寸：2. 6X80cm ;柱料：Sephadex G-25,以 5mg/ml 压柱 12h，至填充量为 70± lcm ; 将GM2-2组分加超纯水配制成lmg/ml的溶液上样，上样量：1. 5ml，超纯水洗脱，洗脱速度： 0· 5ml/min〇
[0012] 本发明的有益效果是： 1、简单易行，生产成本低，可以显著提高水产加工副产品的价值，避免浪费的同时还保 护了环境，还能为开发相关功能性食品提供前期基础。
[0013] 2、产品安全无毒，对肝细胞损伤修复作用好。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1是不同蛋白酶酶解鳕鱼皮所得组分作用经LPS诱导的Chang Liver细胞的细 胞0D值。
[0015] 图2是超滤所得不同组分作用经LPS诱导的Chang Liver细胞的细胞0D值。
[0016] 图3是GM2组分的DEAE-S印harose FF离子柱分离图谱。
[0017] 图4是GM2组分的DEAE-S印harose FF离子柱分离所得不同组分作用经LPS诱导 的Chang Liver细胞的细胞0D值。
[0018] 图5是GM2-2组分Sephadex G-25层析分离图谱。
[0019] 图6是GM2-2组分Sephadex G-25层析分离所得不同组分作用经LPS诱导的Chang Liver细胞的0D值。
[0020] 图7为本发明的产品对DPPH自由基的清除能力图。
[0021] 图8为本发明的产品对ABTS自由基的清除能力图。
[0022] 图9是经本发明的产品作用LPS诱导的Chang Liver肝细胞细胞形态变化，其中A 为正常组，B为LPS诱导组，C为低剂量（5mg/ml) GM2-2-3作用组，D为高剂量（lOmg/ml ) GM2-2-3作用组。
[0023] 图10为流式细胞仪的结果图，其中：A、正常组细胞；B、LPS诱导组细胞；C、低浓 度GM2-2-3 (5mg/ml)作用后细胞；D、高浓度GM2-2-3 (10mg/ml)作用后细胞。
【具体实施方式】
[0024] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0025] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0026] 及试剂 鳕鱼皮购自浙江舟山佳和加食品加工有限公司；正常人肝细胞：张氏肝细胞（Chang Liver细胞）购自中南大学湘雅医学院细胞中心，本实验室传代培养。
[0027] NaOH、冰醋酸等分析纯购自国药集团化学试剂有限公司；RPMI1640培养基购自 Gibco公司；胎牛血清（FBS)购自杭州四季青生物制品有限公司；似!10)3购自上海虹光化 工厂；胰蛋白酶、MTT购自Sigma公司；青霉素、链霉素购自山东鲁抗医药股份有限公司； S印hadex G-25,上海源叶生物科技有限公司；大肠杆菌脂多糖（0111:B4 LPS)、四氮唑蓝 (MTT)均购自sigma公司。
[0028] 实施例1 : 一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤： (1)鳕鱼皮预处理：将鳕鱼皮洗净后用4°C纯水浸泡20min，后用浓度0. Imol/LNaOH浸 泡8小时，用清水冲洗至pH=7,浙干水分后，用浓度0. lmol/L的冰醋酸溶胀12小时，最后用 剪刀剪碎成约lcmX lcm左右小块。
[0029] (2)酶解反应：将步骤（1)预处理后的鳕鱼皮与水按照1:4 (w/v)的料液比混合， 然后加入胰蛋白酶酶解反应，酶解条件为：胰蛋白酶用量为每g鳕鱼皮加入2000U，酶解温 度50°〇邛!16，时间811。
[0030] (3)超滤：步骤（2)酶解反应结束后，KKTC水浴灭酶15min，4°C、10000转/min离 心10min，收集上清液，上清液用超滤膜超滤，截留获得分子量为5-10KDa的组分，冷冻干燥 后得GM2组分。
[0031] (4) DEAE-Sepharose FF 离子交换层析分离：将 GM2 组分上 DEAE-Sepharose FF 离 子交换柱(购自亚太恒信公司），采用PH4. 5的醋酸-醋酸钠缓冲液(醋酸浓度50mmol/l)作 为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后得到GM2-2组分；洗脱条件具体为：GM2组分加超 纯水配制成200mg/ml的溶液上样，每次上样量为2ml，洗脱速度为lml/min。
[0032] (5)3印1^(1616-25层析分离：将612-2组分经3印1^(1616-25凝胶柱洗脱后，从上 样开始计时，收集90-100min时间段洗脱液获得GM2-2-3组分，冷冻干燥后得到肝病辅食型 胶原蛋白肽； Sephadex G-25凝胶柱洗脱条件具体为： 柱尺寸：2. 6X80cm ;柱料：Sephadex G-25,以 5mg/ml 压柱 12h，至填充量为 70± lcm ; 将GM2-2组分加超纯水配制成lmg/ml的溶液上样，上样量：1. 5ml，超纯水洗脱，洗脱速度： 0· 5ml/min〇
[0033] 实施例2 : 一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤： (1)鳕鱼皮预处理：将鳕鱼皮洗净后用4°C纯水浸泡30min，后用浓度0. 2mol/L NaOH浸 泡6小时，用清水冲洗至pH=7,浙干水分后，用浓度0. 2mol/L的冰醋酸溶胀10小时，最后 用剪刀剪碎成约lcmX lcm左右小块。
[0034] (2)酶解反应：将步骤（1)预处理后的鳕鱼皮与水按照1:4 (w/v)的料液比混合， 然后加入胰蛋白酶酶解反应，酶解条件为：胰蛋白酶用量为每g鳕鱼皮加入2000U，酶解温 度50°〇邛!16，时间811。
[0035] (3)超滤：步骤（2)酶解反应结束后，KKTC水浴灭酶15min，4°C、10000转/min离 心lOmin，收集上清液，上清液用超滤膜超滤，截留获得分子量为5-10KDa的组分，冷冻干燥 后得GM2组分。
[0036] (4) DEAE-Sepharose FF 离子交换层析分离：将 GM2 组分上 DEAE-Sepharose FF 离 子交换柱(购自亚太恒信公司），采用PH4. 5的醋酸-醋酸钠缓冲液(醋酸浓度50mmol/l)作 为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后得到GM2-2组分；洗脱条件具体为：GM2组分加超 纯水配制成200mg/ml的溶液上样，每次上样量为2ml，洗脱速度为lml/min。
[0037] (5)3印1^(1616-25层析分离：将612-2组分经3印1^(1616-25凝胶柱洗脱后，从上 样开始计时，收集90-100min时间段洗脱液获得GM2-2-3组分，冷冻干燥后得到肝病辅食型 胶原蛋白肽； Sephadex G-25凝胶柱洗脱条件具体为： 柱尺寸：2. 6X80cm ;柱料：Sephadex G-25,以 5mg/ml 压柱 12h，至填充量为 70± lcm ; 将GM2-2组分加超纯水配制成lmg/ml的溶液上样，上样量：1. 5ml，超纯水洗脱，洗脱速度： 0· 5ml/min〇
[0038] 工艺分析研究 1、最佳酶种及酶解条件选择 1. 1选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶作供选酶，按照蛋 白酶各自的最适作用温度和pH值（见表1)酶解已经预处理的鱼皮，加酶量为4000U/g，料 液比为1:4,反应5h,酶解预处理后的鱼皮原料。 表1不同觸的最适温度和pH 最适温度（τ) 最适pH _喊性蛋白酶__55__10J_ 中性蛋白酶 35-45 6.5-7.5 _胃蛋白酶__3>45__3_ 木瓜蛋白酶 45 ^ 6-0 _陳蛋白酶__50__SJ_
[0039] 酶解完毕后，10(TC灭酶lOmin，过滤后冷冻干燥，备用。
[0040] 正交试验 在初步确定酶解条件的基础上，选择酶解时间、pH值、加酶量、温度等因素，设计正交试 验，因素与水平见表2。
【权利要求】
1. 一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 鳕鱼皮预处理：将鳕鱼皮洗净后用4°C纯水浸泡20-30min，后用浓度0. l-o. 2mol/L NaOH浸泡6-8小时，用清水冲洗至pH=7,浙干水分后，用浓度0. 1-0. 2mol/L的冰醋酸溶胀 10-12小时，最后用剪刀剪碎； (2) 酶解反应：将步骤（1)预处理后的鳕鱼皮与水按照1:4 (w/v)的料液比混合，然后 加入胰蛋白酶酶解反应； (3) 超滤：步骤（2)酶解反应结束后，灭酶，离心，收集上清液，上清液用超滤膜超滤，截 留获得分子量为5-10KDa的组分，冷冻干燥后得GM2组分； (4) DEAE_Sepharose FF离子交换层析分离：将GM2组分上DEAE-Sepharose FF离子交换 柱，采用PH4. 5的醋酸-醋酸钠缓冲液作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后得到GM2-2 组分； (5) Sephadex G-25层析分离：将GM2-2组分经Sephadex G-25凝胶柱洗脱后，从上样开 始计时，收集90-100min时间段洗脱液获得GM2-2-3组分，冷冻干燥后得到肝病辅食型胶原 蛋白肽。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2)酶解条件为：胰蛋白酶用量 为每g鳕鱼皮加入2000U，酶解温度50°C，pH 6,时间8h。
3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤（4)中DEAE-Sepharose FF 离子交换柱的洗脱条件具体为：GM2组分加超纯水配制成200mg/ml的溶液上样，每次上样 量为2ml，洗脱速度为lml/min。
4. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤（5冲S印hadex G-25凝胶 柱的洗脱条件具体为： 柱尺寸：2. 6X80cm ;柱料：Sephadex G-25,以 5mg/ml 压柱 12h，至填充量为 70± lcm ; 将GM2-2组分加超纯水配制成lmg/ml的溶液上样，上样量：1. 5ml，超纯水洗脱，洗脱速度： 0· 5ml/min〇
【文档编号】C12P21/06GK104152518SQ201410200628
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年5月14日 优先权日:2014年5月14日
【发明者】丁国芳, 滕芳芳, 杨最素, 刘晨晨 申请人:浙江海洋学院