一种pcr扩增引物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体公开了一种PCR扩增引物及其应用。本发明所述PCR扩增引物由具有SEQ?ID?NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ?ID?NO:2所示核苷酸序列的下游引物组成，其对于枯草芽孢杆菌(Bacillus?subtilis)的β-D-葡萄糖苷酶基因检测具有较好的适应性，特别是适合于分离自香草兰的枯草芽孢杆菌，能够广泛应用到枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因的检测以及检测枯草芽孢杆菌(Bacillus?subtilis)β-D-葡萄糖苷酶基因试剂盒的制备中，可以协助产β-D-葡萄糖苷酶菌株的筛选工作。
【专利说明】—种PCR扩增引物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，更具体的说是涉及一种PCR扩增引物及其应用。
【背景技术】
[0002]香草兰原产墨西哥，属兰科攀缘藤本。香草兰是高级食用香料，有“食用香料之王”之称，豆荚含有2~3%的香兰素，广泛用于食品工业中。
[0003]香草兰发酵豆荚的最主要风味物质为香兰素，其中香兰素由其前体香兰素葡萄糖苷经豆荚自身携带的内源β-D-葡萄糖苷酶水解而形成。目前已分离到多种产β-D-葡萄糖苷酶的细菌。但是，从香草兰上分离的各种菌株不是都能分泌出的β-D-葡萄糖苷酶，这需要通过生物技术手段进行鉴定。[0004]至今已有多项研究报道了 β-D-葡萄糖苷酶基因的扩增引物序列，但是细菌中的蛋白编码基因变异度较大，不同菌种、不同来源的菌株其蛋白编码基因序列差异较大，扩增引物的适用范围有限，本领域关于分离自香草兰的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的性质还未有深入的研究，特别是针对这些菌株的β -D-葡萄糖苷酶基因的检测引物未见有报道。
[0005]因此，现阶段需要一种新型的生物技术手段用于检测枯草芽孢杆菌是否携带有β -D-葡萄糖苷酶基因，特别是分离自香草兰的枯草芽孢杆菌，以此来协助产β -D-葡萄糖苷酶的菌株的筛选工作。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种PCR扩增引物，使得所述PCR扩增引物能够扩增枯草芽孢杆菌β -D-葡萄糖苷酶基因，具有较好的适用性。
[0007]本发明的另一个目的在于提供一种PCR扩增引物，使得所述PCR扩增引物能够扩增分离自香草兰的枯草芽孢杆菌β -D-葡萄糖苷酶基因，具有较好的适用性。
[0008]本发明的另一个目的在于提供所述PCR扩增引物在制备检测枯草芽孢杆菌β -D-葡萄糖苷酶基因试剂盒中的应用以及一种检测枯草芽孢杆菌β -D-葡萄糖苷酶基因的试剂盒。
[0009]本发明的另一个目的在于提供所述PCR扩增引物在检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因中的应用以及一种检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因的方法。
[0010]为实现本发明目的，本发明提供如下技术方案:
[0011]一种PCR扩增引物，由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQID Ν0:2所示核苷酸序列的下游引物组成。
[0012]利用本发明提供的上下游引物对分离自香草兰的枯草芽孢杆菌基因组扩增，PCR扩增产物测序后，将测序所得序列去除前端和末尾序列片段，并将结果整理成FASTA格式的文件，采用NCBI数据库中的BLAST软件进行比对。结果显示，与扩增产物序列同源性高的均为芽孢杆菌属(Bacillus sp.) β-D-葡萄糖苷酶基因。表明本发明所述PCR扩增引物能够扩增枯草芽孢杆菌β -D-葡萄糖苷酶基因，具有较好的适用性。
[0013]基于此，本发明还提供所述PCR扩增引物在制备检测枯草芽孢杆菌β -D-葡萄糖苷酶基因试剂盒中的应用。优选地，所述枯草芽孢杆菌分离自香草兰。
[0014]同时，基于上述应用，本发明提供一种检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因的试剂盒，包括具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID Ν0:2所示核苷酸序列的下游引物。
[0015]作为优选，所述试剂盒还包括Taq酶、dNTP和PCR buffer。
[0016]此外，本发明还提供所述PCR扩增引物在检测枯草芽孢杆菌β -D-葡萄糖苷酶基因中的应用。优选地，所述枯草芽孢杆菌分离自香草兰。
[0017]基于上述应用，本发明提供一种检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因的方法，用具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID Ν0:2所示核苷酸序列的下游引物对枯草芽孢杆菌的DNA进行PCR扩增，然后琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
[0018]作为优选，所述PCR扩增体系为:
[0019]2.0 μ LlOXPCR buffer, 200 μ M dNTP，80nM 上游引物，80ηΜ 下游引物，1.0U Taqpolymerase及0.8 μ L枯草芽抱杆菌DNA。
[0020]作为优选，所述枯草芽孢杆菌分离自香草兰。 [0021]作为优选，所述PCR扩增程序为:
[0022]940C 3min ；
[0023]94°C 60s, 60-67°C 60s 或 54? 60s, 72°C 75s，共 30 个循环；
[0024]72O保持 IOmin。
[0025]本发明从香草兰豆荚中分离出两株经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌株一XY19与XY20，用本发明所述PCR扩增引物扩增后，扩增产物均鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.) β-D-葡萄糖苷酶基因。
[0026]此外，本发明利用所述PCR扩增引物扩增芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株的DNA,琼脂糖电泳无法检测到扩增条带；同时,本发明采用现有的两条(LUN-CHENG KUO 等 J.Agric.Food Chem.2008，56，119-125，序列见 SEQ ID NO: 3SEQ ID NO:4)用于检测β -D-葡萄糖苷酶基因的引物对ΧΥ19与ΧΥ20的DNA进行扩增，琼脂糖电泳无法检测到扩增条带。
[0027]由以上技术方案可知，本发明针对现有技术的空白，在深入研究枯草芽孢杆菌β -D-葡萄糖苷酶的基础上，提供了一对全新的PCR扩增引物，能够广泛应用到枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因的检测以及检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因试剂盒的制备中，特别是适合于分离自香草兰的枯草芽孢杆菌，可以协助产β-D-葡萄糖苷酶菌株的筛选工作。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1所示为本发明所述扩增引物扩增菌株ΧΥ19和ΧΥ20的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为Maker，A为菌株XY19扩增产物条带，B为XY20扩增产物条带。
【具体实施方式】[0029]本发明公开了一种PCR扩增引物及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述PCR扩增引物已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0030]下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0031]实施例1:从香草兰中分离产β -D-葡萄糖苷酶的菌株
[0032]1、分离方法
[0033]取香草兰豆荚热水70°C杀青5min，杀青后豆荚50°C热风发汗25h，然后再经室温干燥I个月，最后室温陈香半年即完成发酵处理。
[0034]取发酵完成的香草兰豆荚置于无菌水中，充分震荡后，将0.2mL混合液涂布于LB平板培养基(lL:10g NaCl，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，15g琼脂，pH为7.0)上，28°C培养24h后，固体平板上长出菌落。挑取单菌落经3次划线纯化培养，获取单一菌株。
[0035]分别将经纯化的菌株接种于含七叶苷和柠檬酸高铁氨的LB固体培养基(1L培养基:IOg NaCl，IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，15g琼脂，Ig七叶苷，2.5g柠檬酸高铁氨，pH为
7.0)上28°C培养24h，挑取平板上产生黑色水解圈的菌落，命名为菌株XY19和XY20。
[0036]2、水解香兰素葡萄糖苷的能力试验
[0037]配置以香兰素葡萄糖苷为唯一碳源的无机盐液体培养基(MM) =NH4NO3L 5g/L,K2HPO4L 5g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO40.2g/L，NaCllg/L, pH7.0，其中香兰素葡萄糖苷浓度为220mg/L。
[0038]将芽孢杆菌XY19和XY20分别接种于上述培养基中，28°C 170rpm摇床培养24h后，培养基中香兰素葡萄糖苷浓度均为0，被完全水解，同时培养基中检测到香兰素，表明所筛选的两株菌株含有β -D-葡萄糖苷酶基因。
[0039]实施例2:分离菌株的鉴定
[0040]1、形态及生理生化检测
[0041]分别检测菌株ΧΥ19和ΧΥ20在LB平板上的生长情况、菌落形态与颜色、革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色等，方法参照沈萍主编的《微生物学实验(第三版)》的方法进行。所得菌株ΧΥ19和ΧΥ20在LB培养基平板上，菌落颜色均为不透明乳白色，圆形菌落边缘整齐中间略微拱起。显微观察菌体为单细胞，杆状。革兰氏染色为阳性，芽孢椭圆或卵圆形。
[0042]检测菌株ΧΥ19和ΧΥ20分别在不同温度下、不同pH值条件下、不同NaCl浓度下进行LB液体培养，培养的温度最优选择为28-35°C;培养的pH值最优选择为5.0-7.0 ;培养的NaCl最优浓度选择为I %。
[0043]2、16S rDNA序列的测定
[0044]参照细菌基因组DNA提取方法(天根生化科技有限公司DP302-02)，用细菌16SrDNA通用引物A8-27f和B1523_1504r进行PCR扩增。
[0045]25μ L 的反应体系:2.5μ L10XPCR buffer, 200 μ M dNTP (each)，80nM A8_27f，80nM B1523-1504r, 1.25U Taq polymerase (Takara, Dalian, and PRC)和 IyL基因组DNA(approx.1Ong)。
[0046]PCR 扩增反应条件:94°C 3min ；94°C Imin，56°C Imin，72°C 2min,共 30 个循环；然后72°C保持lOmin。PCR产物委托华大基因有限公司进行直接测序(XY19的16S rDNA序列参见SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列，XY20的16S rDNA序列参见SEQ ID NO:6所示核苷酸序列)。测得的序列用BLAST软件进行序列比对分析，并与GenBank中已知的16S rDNA进行同源性比较。
[0047]检测结果如下:
[0048]将该PCR扩增产物在GenBank中(登录号:KF986321，KF986322)进行BLAST比对。结果表明，与菌株XY19和XY20同源性高的菌株均是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，其同源性达99%以上，由此可推断菌株XY19和XY20属芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。
[0049]采用多种生物学软件对测得的序列进行分析，构建系统发育树。用于系统发育分析的其它所有菌株序列及相关资料均来自GenBank数据库。首先下载该数据库中Bacillus属与XY19和XY20亲缘关系较近的种模式菌株序列，整理成FASTA格式的文件。根据用Clustalxl.81软件进行比对的结果，对所选择出的序列长度进行整理，使用于系统发育分析的序列长度基本一致。采用MEGA5.05软件构建系统发育树。
[0050]系统发育学分析显示，菌株XY19和XY20与B.subtilis DSMlO聚为一支。16S rDNA序列同源性分析发现菌株XY19和XY20与B.subtilis DSMlO的序列相似性均为100%。
[0051]结合生理生化和16S rDNA分析结果，将菌株XY19和XY20鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
[0052]实施例 3:分离菌株DNA的扩增和检测
[0053]参照细菌基因组DNA提取方法(天根生化科技有限公司DP302-02)分别对菌株XY19和XY20进行DNA提取，然后采用本发明所述PCR扩增引物进行扩增，PCR扩增产物用Agarose gel进行电泳分离后，DuGreen染色，UV下观察,结果见图1。
[0054]PCR扩增体系为:
[0055]2.0 μ LlOXPCR buffer, 200 μ M dNTP，80nM 上游引物，80ηΜ 下游引物，1.0U Taqpolymerase 及 0.8 μ L 枯草芽抱杆菌 DNA (约 IOng)。
[0056]PCR扩增程序为:
[0057]940C 3min ；
[0058]94°C 60s, 54°C 60s, 72°C 75s，共 30 个循环；
[0059]72?保持 IOmin。
[0060]PCR扩增产物经电泳检测产物浓度符合测序要求的样品，委托华大基因有限公司进行直接测序(XY19的扩增产物序列参见SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列，XY20的扩增产物序列参见SEQ ID N0:8所示核苷酸序列)。
[0061]将测序所得序列去除前端和末尾序列片段，并将结果整理成FASTA格式的文件，采用NCBI数据库中的BLAST软件进行比对。结果表明，与扩增产物序列同源性高的均为芽孢杆菌属(Bacillus sp.) β-D-葡萄糖苷酶基因。
[0062]实施例4:扩增对比试验
[0063]以菌株ΧΥ19和ΧΥ20基因组DNA为模版，然后采用现有的两条(LUN-CHENG KUO等 J.Agric.Food Chem.2008，56，119-125，序列见 SEQID NO: 3 和 SEQ ID NO:4)用于检测β-D-葡萄糖苷酶基因的引物对XY19与XY20的DNA进行扩增，PCR扩增产物用Agarosegel进行电泳分离后，DuGreen染色，UV下观察。[0064]同时，以芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株的DNA为模版，然后以本发明所述扩增引物进行扩增，PCR扩增产物用Agarose gel进行电泳分离后，DuGreen染色，UV下观察。
[0065]PCR扩增体系为:
[0066]2.0 μ LlOXPCR buffer, 200 μ M dNTP，80nM 上游引物，80ηΜ 下游引物，1.0U Taqpolymerase 及 0.8 μ L 枯草芽抱杆菌 DNA (约 IOng)。
[0067]PCR扩增程序为:
[0068]94°C 3min ；
[0069]94°C 60s, 60-67°C 60s 或 54? 60s, 72°C 120s，共 30 个循环；
[0070]72O保持 IOmin。
[0071]结果显示，无论是哪一种对比试验，PCR扩增产物经电泳检测产物未能检测到条带，说明没有扩增出XY19、XY20的β-D-葡萄糖苷酶编码基因。
[0072]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的 保护范围。
【权利要求】
1.一种PCR扩增引物，其特征在于，由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游引物组成。
2.权利要求1所述PCR扩增引物在制备检测枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)β -D-葡萄糖苷酶基因试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌分离自香草兰。
4.一种检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因的试剂盒，其特征在于，包括具有SEQID NO:1所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，还包括Taq酶、dNTP和PCRbuffer。
6.权利要求1所述PCR扩增引物在检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌分离自香草兰。
8.—种检测枯草芽孢杆菌β-D-葡萄糖苷酶基因的方法，其特征在于，用具有SEQ IDNO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID Ν0:2所示核苷酸序列的下游引物对枯草芽孢杆菌的DNA进行PCR扩增，然后琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为: 2.0 μ LlO XPCR buffer, 200 μ M dNTP，80nM 上游引物，80nM 下游弓丨物，1.0U Taqpolymerase及0.8 μ L枯草芽抱杆菌DNA。
10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌分离自香草兰。
【文档编号】C12Q1/68GK103923914SQ201410200539
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年5月13日 优先权日:2014年5月13日
【发明者】谷风林, 陈永敢, 王庆煌, 李积华, 贺书珍, 徐飞, 房一明, 谭乐和 申请人:中国热带农业科学院香料饮料研究所