一种简便高效的动物血液dna提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种简便高效的动物血液DNA提取方法，属于分子生物学【技术领域】。本发明通过稀释液和裂解液Ⅰ很好的去除红细胞，再通过裂解液Ⅱ和蛋白酶K破碎白细胞，并降解膜蛋白，核蛋白等蛋白质，释放基因组DNA。用乙酸铵中和蛋白质所带电荷，促进蛋白沉淀，再通过无水乙醇沉淀DNA，75％乙醇洗涤沉淀后自然晾干，最后TE溶解保存。该方法操作简单，所需试剂均为常规试剂，成本低，所得DNA质量也比较好，适合于实验室进行大、中和小型规模的DNA提取或商业公司试剂盒的生产。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种简便高效的动物血液DNA提取方法，属于分子生物学【技术领域】。 一种简便高效的动物血液DNA提取方法
【背景技术】
[0002] DNA提取是分子生物学的基本实验，涉及了基因克隆、基因序列分析、基因重组和 基因治疗，以及遗传育种等【技术领域】。血液DNA提取和纯化的一般程序为：破碎红细胞、离 心沉淀白细胞、破碎白细胞、沉淀去蛋白、分离和纯化DNA。经典的血液DNA提取方法酚氯仿 抽提法。这种方法一般可以得到质量和纯化较好的能够长时间保存的DNA，对满足基本的小 规模分子实验工作需求已足够，但是这种方法在实验过程所用到的苯酚、氯仿、异丙醇等试 剂对人体毒害较大。研究试验中，常用的除了酚氯仿抽提法，主要是用各种血液DNA抽提试 剂盒，这些DNA提取试剂盒往往价格不菲。目前许多科学研究和应用，都受制于量大质优的 血液DNA提取技术的不足。所以一种低毒害、价格低廉、DNA提取效果好、而且能按照样本 量的多少随意设定DNA的提取规模的血液DNA提取方法有很大的科研和临床应用价值，能 有效提高后续工作的效率。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供了一种简便、价格低廉、高效的动物血液DNA提 取方法。
[0004] 所述方法的具体步骤为：
[0005] (1)血液稀释：在lmL全血样本中加入稀释液，血液与稀释液的体积比为1 :5,颠 倒混匀；
[0006] (2)去除红细胞：在上述溶液中加入与血液体积相同的甲醇-乙酸混合液（裂解 液I )，颠倒混勻，4000rpm离心5分钟，弃上清，得到残留细胞团；向细胞团中加入5倍血 液体积的甲醇-乙酸混合液，吹散混匀，3000rpm离心5分钟，弃上清，重复加入5倍血液体 积的甲醇-乙酸混合液、吹散混匀离心弃上清2-3次，直至上清液变无色；
[0007] (3)裂解白细胞沉淀蛋白：将得到的细胞团转入1. 5ml微量离心管中，加入适量 的双蒸水混匀，5000rpm离心5分钟，弃上清，加入细胞裂解液（裂解液II )0· 4ml、10 μ 1浓 度为20mg/ml的蛋白酶Κ，56°C孵育3小时；再加入100 μ 18Μ的乙酸铵混勻，8000rpm离心 15min ；
[0008] (4)分离纯化DNA :吸取0. 4ml上清液，加入2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻混 勻，待出现絮状沉淀后，12000rpm离心15min，弃上清；再加入lml70 %乙醇洗漆沉淀， 12000rpm，离心15min，弃上清；干燥沉淀5-10min，加入30-50 μ 1TE溶解DNA。
[0009] 所述的离心与操作步骤均在室温下进行。
[0010] 所述稀释液为0.068Μ的KC1溶液。
[0011] 所述甲醇-乙酸混合液是由甲醇与乙酸等体积混合。
[0012] 所述细胞裂解液成分为：0. 01Μ Tris-HCl、lmM EDTA、1% SDS(m/v)的混合液。
[0013] 本发明提供的方法步骤简单，所需试剂均为常规试剂，价格低廉。此外，操作过程 对设备要求低，操作简单，对操作人员要求较低，也在很大程度上避免了使用酚、氯仿等毒 性较高试剂对操作人员的伤害；采用本方法提取的DNA浓度和质量都很好，可直接用于PCR 和分子生物学实验。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1貉血液DNA提取过程中无水乙醇沉淀。
[0015] 图2貉血液DNA提取及PCR结果，Lanel，2为貉基因组；Lane3和Lane6都是 DL-2000 ;Lane4, 5, 7-15是不同引物的PCR结果。
[0016] 图3通过国产某DNA试剂盒和传统的酚-氯仿法提取貉血液DNA，Lanel是酚-氯 仿法；Lane2是DL-2000Marker ;Lane3是国产某试剂盒。
[0017] 图4银狐血液DNA提取，Lanel和Lane2都是银狐基因组，Lane2上样量减半。
[0018] 图5银狐不同基因的PCR结果，Lane7, 14, 21是：DL-2000Marker ;其余孔道是不同 基因引物的梯度PCR结果。
[0019] 图6通过国产某DNA试剂盒和传统的酚-氯仿法提取银狐血液DNA，Lanel是国产 试剂盒提取结果；Lane2是传统的酚-氯仿法提取法。
【具体实施方式】
[0020] 以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本 发明范围。
[0021] 材料和试剂：
[0022] 稀释液：0· 068M KC1
[0023] 裂解液 I :V_ :Viig= 1 :1
[0024] 裂解液 Π :0· 01M Tris-HCl
[0025] ImM EDTA
[0026] 1% (m/v)SDS
[0027] 无水乙醇，8M乙酸铵。
[0028] 配制制剂的水均为ddH20 ;所用的枪头和EP管也均经高压灭菌。
[0029] 实施例1貉基因组DNA的提取
[0030] 1、取lmL貉血液放入10ml离心管中，加入稀释液5ml，混勻，静置片刻；
[0031] 2、向稀释后的血液中加入1ml裂解液I，混勻，4000rpm离心5min，弃上清；
[0032] 3、加入5ml裂解液I，混勻，3000rpm离心5min，弃上清；可重复此步骤1-2次，直 至上清液变无色；
[0033] 4、将步骤3所得到的细胞团转入1. 5ml微量离心管中，加入ddH20混匀，5000rpm， 离心5分钟，弃上清；
[0034] 5、加入0. 4ml裂解液II、10 μ 1浓度为20mg/ml的蛋白酶K，56°C孵育3小时；
[0035] 6、在步骤5所得溶液中加入100μ 18M的乙酸铵混匀，8000rpm，离心lOmin ;
[0036] 7、取步骤6所得溶液的上清液0. 4ml，置于新的1. 5ml微量离心管中，再加入 0. 8ml无水乙醇，轻轻颠倒混勻；
[0037] 8、在室温下放置5-10min，待出现絮状沉淀时，12000rpm，离心15min，弃上清液；
[0038] 9、加入lmUO%乙醇洗漆沉淀，12000rpm、离心15mi，弃上清；
[0039] 10、干燥沉淀 5-10min，加入 30-50 μ 1TE 溶解 DNA。
[0040] 结果：以此貉血液提取基因组DNA，在无水乙醇沉淀时，可见明显的絮状沉淀，如 图1所示。所得基因组DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，完整性好，如图2所示。经过 核酸定量仪的测定，终浓度约〇. 2yg/y 1，0D260/280在1.7到1.9之间。提取的DNA经 PCR扩增得到所需目的条带，如图2所示。
[0041] 本样品同时采用了国内某厂家的试剂盒和传统的酚-氯仿提取法。结果如图3所 示，采用试剂盒提取的DNA容易降解，产生弥散带；而采用传统的酚-氯仿法提取DNA，残留 的蛋白量多，提取的DNA量较少。
[0042] 实施例2银狐基因组DNA的提取
[0043] 1、取lmL银狐血液放入10ml离心管中，加入稀释液5ml，混匀，静置片刻；
[0044] 2、向稀释后的血液中加入1ml裂解液I，混勻，4000rpm离心5min，弃上清；
[0045] 3、加入5ml裂解液I ,混勻，3000rpm离心5min，弃上清；可重复此步骤1-2次，直 至上清液变无色；
[0046] 4、将步骤3所得到的细胞团转入1. 5ml微量离心管中，加入ddH20混匀，5000rpm， 离心5分钟，弃上清；
[0047] 5、加入0.41111裂解液11、1(^1浓度为2〇11^/1111的蛋白酶1(，561：孵育3小时 ；
[0048] 6、在步骤5所得溶液中加入ΙΟΟμ 18M的乙酸铵混匀，8000rpm，离心lOmin ;
[0049] 7、取步骤6所得溶液的上清液0. 4ml，置于新的1. 5ml微量离心管中，再加入 0. 8ml无水乙醇，轻轻颠倒混勻；
[0050] 8、在室温下放置5-10min，待出现絮状沉淀时，12000rpm，离心15min，弃上清液；
[0051] 9、加入lmUO%乙醇洗漆沉淀，12000rpm、离心15mi，弃上清；
[0052] 10、干燥沉淀 5-10min，加入 30-50 μ 1TE 溶解 DNA。
[0053] 结果：此以银狐血液提取基因组DNA，所得基因组DNA经0. 8 %的琼脂糖凝胶电泳 检测，完整性好，如图4所示。经过核酸定量仪的测定，终浓度约0. 1μ g/μ l，0D260/280在 1. 7到1. 9之间。提取的DNA经PCR扩增得到所需目的条带，如图5所示。
[0054] 本样品同时采用了国内某厂家的试剂盒和传统的酚-氯仿提取法。结果如图6所 示，采用试剂盒提取的DNA发生降解，易产生弥散带；而采用传统的酚-氯仿法提取DNA，残 留的蛋白量多，提取的DNA量较少。
【权利要求】
1. 一种简便高效的动物血液DNA提取方法，其特征在于， (1) 血液稀释：在lmL全血样本中加入稀释液，血液与稀释液的体积比为1 :5,颠倒混 匀； (2) 去除红细胞：向上述溶液中加入与血液体积相同的甲醇-乙酸混合液，颠倒混匀， 离心弃上清，得到残留细胞团；向细胞团中加入5倍血液体积的甲醇-乙酸混合液，吹散混 匀，离心弃上清，重复2-3次，直至上清液变无色； (3) 裂解白细胞沉淀蛋白：将得到的细胞团转入1. 5ml微量离心管中，加入适量的双 蒸水混匀，离心弃上清，加入细胞裂解液〇.4πι1、1〇μ 1浓度为20mg/ml的蛋白酶K，56°C孵 育3小时；再加入ΙΟΟμ 18M的乙酸铵混匀、离心；所述细胞裂解液是0. 01M Tris-HCl、lmM EDTA、1% SDS的混合液； (4) 分离纯化DNA :用无水乙醇沉淀DNA，并用70%乙醇洗涤沉淀。
2. 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（1)所述稀释液为0. 068M的KC1 溶液。
3. 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（2)所述甲醇与乙酸混合液中甲醇 与乙酸的体积比为1 :1。
4. 如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤（4)分离纯化DNA是吸取 0. 4ml上清液，加入2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻混匀，待出现絮状沉淀后，离心弃上清； 再加入lml70 %乙醇洗涤沉淀，离心弃上清；干燥沉淀，加入30-50 μ 1 TE溶解DNA。
【文档编号】C12N15/10GK104109663SQ201410201162
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年5月13日 优先权日:2014年5月13日
【发明者】杨福合, 鲍加荣, 王桂武, 王雷, 刘宗岳 申请人:中国农业科学院特产研究所