一种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的引物、探针及检测方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】一种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的引物、探针及检测方法和试剂盒，所述的引物由上游引物Yeast?F1和下游引物Fungus?R1组成，所述的上游引物Yeast?F1的碱基序列为GAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAA，下游引物Fungus?R1的碱基序列为TCCTTCCCTTTCAACAATTTCAC。所述探针的碱基序列为TGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCC。本发明提供的引物和探针具有良好的灵敏度和特异性。本发明整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于同时检测常见腐败酵母菌的核苷酸片段的引物和探针序列 及检测方法和试剂盒。 -种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的引物、探针及检测 方法和试剂盒
【背景技术】
[0002] 大量酵母的存在可引起食品风味下降或变质，由酵母引起的食品腐败越来越受到 重视。酵母不仅在低湿度、低pH值或高盐高糖的食品中抵抗力较强，同时对防腐剂、冷冻、 电离辐射照射的抵抗力强，随着食品防腐剂及电离辐射照射等相关技术的应用，普通致病 性或腐败性细菌被有效杀灭，酵母则成为引起食品变质的优势菌酵。在常见的发酵食品、海 产食品、腌制食品等食品中很容易发生酵母引起的腐败，腐败酸奶中可分离出汉逊德巴利 酵母（Debaryomyces hansenii)、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)、解脂耶 罗维亚酵母（Yarrowia lipolytaca);在半软和软奶酪中，假丝酵母属、蔷薇酵母属和隐球 酵母等会引起臭味、软化、产气、变色和涨袋；诞沫假丝酵母（Candida zeylanoides)、逊德 巴利酵母（Debaryomyces hansenii)、清酒假丝酵母（Candida sake)等酵母都能引起火腿、 香肠等肉制品感官品质的改变引起腐败。食品中常见腐败酵母如表1所示，酵母引起的食 品变质和腐败给食品工业造成巨大的安全风险，因此寻找一个快速简便、能同时检测多种 食品种腐败性和致病性酵母的检测方法意义重大。
[0003] 目前检测酵母菌的方法有传统的培养法、抗体抗原免疫法、聚合酶链式反应（PCR) 技术等。传统的培养法方便、成本低，但所需时间至少要5天，无法适应现代高通量快速检 测的需求；抗体抗原免疫法具有较高的灵敏度和特异性，但存在成本较高、筛选抗体困难和 不能同时检测多种抗原的能力，无法满足食品中多种食品种腐败性和致病性酵母同时检测 的要求。传统PCR特异性强、灵敏度高、快速、简便，但有易受到污染，需要使用有毒试剂EB 等缺点，实时荧光定量PCR是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，不但具备传 统PCR的优点，而且克服了易受到污染，需要使用有毒试剂EB等缺点，该检测方法具有快 速、简便、直观、定量准确等优势，已被成功应用于临床疾病诊断、动物疾病检测、食品安全、 科学研究等多种领域的研究检测。
[0004] 表1食品中常见腐败型酵母
[0005]
【权利要求】
1. 一种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的引物，其特征在于，所述的引物由上游 引物Yeast F1和下游引物Fungus R1组成，所述的上游引物Yeast F1的碱基序列为 GAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAA，下游引物 Fungus R1 的碱基序列为 TCCTTCCCTTTCAACAATTTCAC。
2. -种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的探针，其特征在于，所述探针的碱基序列为 TGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCC。
3. -种腐败酵母菌核苷酸片段的检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
4. 根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
5. -种腐败酵母菌核苷酸片段的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 按照权利要求1和2的序列设计引物和探针； (2) 按照DNA提取试剂盒提取待测样品中酵母基因组DNA作为模板； (3) 建立反应体系 利用上述引物和探针进行反应体系的建立，确定采用的荧光PCR反应体系，以20μ 1体 系计，所需各组分及相应浓度如下：
(4) 选择仪器的检测通道 在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧 光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致； (5) 上机检测 将上述20 μ 1的反应体系进行荧光PCR检测；经检测，若待测样品中含有腐败酵母则显 示阳性扩增曲线；若待检培养液中不含有酵母菌则无扩增信号。
6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述PCR条件选择如下：95°C lmin， 1个循环； 95°C 5sec，6(TC 40sec，40 个循环。
7. 根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述荧光PCR反应体系如下，以 20 μ 1体系计：
8. 根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述腐败酵母菌为假 丝酵母属（Candida)、隐球酵母属（Cryptococcus)、地丝菌属（Geotrichum)、蔷 薇酵母属（Rhodotorula)、接合酵母属（Zygosaccharomyces)、德克/酒香酵母 (Dekkera/Brettanomyces)、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces)或异常毕赤酵母 (Wickerhamomyces(Pichia)anomala)〇
9.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述腐败酵母菌为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis)、斯巴达毕赤酵 母（Pichia Sparta)、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii)或浅红酵母（Rhodotorula pallida Lodder)〇
【文档编号】C12N15/11GK104109711SQ201410201044
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年5月13日 优先权日:2014年5月13日
【发明者】肖性龙, 万松华, 余以刚, 吴晖, 李晓凤, 胡双芳 申请人:华南理工大学