用于检测传染性胰脏坏死病毒的lamp引物组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测传染性胰脏坏死病毒的LAMP引物组合物及其应用，该LAMP引物组合物由序列为SEQ?ID?No.1所示的正向内引物FIP、序列为SEQ?ID?No.2所示的反向内引物BIP、序列为SEQ?ID?No.3所示的正向外引物F3、序列为SEQ?ID?No.4所示的反向外引物B3组成。本发明的LAMP引物组合物用于快速检测样品中的传染性胰脏坏死病毒，对于传染性胰脏坏死病毒具有良好的特异性和灵敏度，所需检测仪器简单，能够快速、高效、准确检测传染性胰脏坏死病毒，适合口岸检验检疫机构和基层实验室推广。
【专利说明】用于检测传染性胰脏坏死病毒的LAMP引物组合物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及用于检测传染性胰脏坏死病毒的LAMP引物组合物及其应用。
【背景技术】
[0002]传染性膜脏坏死病毒(Infectiouspancreatic necrosis virus,IPNV)是一种经济上非常重要的鱼病病原体，在鲑科鱼类中能够引起及其严重的感染，导致高的死亡率。最初只在北美及欧洲的一些国家流行，近年来随着水生动物进口贸易的增加，传染性胰脏坏死病已传入我国并在一些地区流行，造成了严重的经济损失。目前，我国对该病病原IPNV的检测方法主要有病毒分离与鉴定方法、反转录-聚合酶链式反应方法、酶联免疫吸附试验方法等，这些检测方法虽已达到准确的诊断，但是耗时长、成本高、仪器设备要求高，检测步骤复杂，不能满足快速、准确检测该病毒的需求。因此，需要建立一种针对IPNV的快速、有效、准确且适合野外现场操作的方法，为我国的鲑鳟鱼类养殖提供科学有效的疫病疫情预防思路。
[0003]LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)法是 2000 年由 Notomi 等发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该方法采用特异地识别靶序列上六个区域的四条引物(两条外引物，两条内引物)及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在65°C左右进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达到IO9-1Oltl个拷贝数量级。整个反应仅需I小时，在扩增反应中副产物焦磷酸镁沉淀与钙黄绿素结合，产生黄绿色荧光，不需要借助其他仪器便可辨别实验结果。但目前该方法还没有应用于IPNV的检测。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种用于快速、准确检测传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的LAMP引物组合物。
[0005]本发明的另一目的在于该LAMP引物组合物的应用。
[0006]本发明的目的可通过如下技术方案来实现:
[0007]一种用于检测传染性胰脏坏死病毒的LAMP引物组合物，该引物组合物由序列为SEQ ID N0.1所示的正向内引物FIP、序列为SEQ ID N0.2所示的反向内引物BIP、序列为SEQ ID N0.3所示的正向外引物F3、序列为SEQ ID N0.4所示的反向外引物B3组成。
[0008]本发明还提供上述LAMP引物组合物在检测传染性胰脏坏死病毒中的应用，包括以下步骤:
[0009](I)提取样品中的RNA ；
[0010](2)以步骤⑴中提取的RNA为模板，进行RT-LAMP扩增反应；
[0011 ] (3)对步骤(3)得到的RT-LAMP扩增产物进行检测。
[0012] 在上述步骤⑵中，RT-LAMP扩增反应条件为:60_65°C下反应30_90分钟，停止反应；最为优选的反应条件为:62°C下反应60分钟，停止反应。
[0013]在上述步骤(3)中LAMP扩增产物可以采用如下方法判定样品中是否含有传染性胰脏坏死病毒:①扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，如果在远离点样孔出现梯状条带，则证明所检测的病毒为传染性胰脏坏死病毒，样品中含有该病毒；②扩增产物中加入双链DNA(dsDNA)染料PicoGreen显色剂后观察荧光颜色变化，如果反应后的反应液显示绿色荧光，则证明所检测的病毒为传染性胰脏坏死病毒，样品中含有该病毒；③从LAMP扩增反应开始时刻即通过Loopamp池度仪检测反应液,至扩增反应结束，观察LAMP池度仪检测图，如果浊度逐渐增加，模块的颜色由绿色逐渐转变为红色，则证明所检测的病毒为传染性胰脏坏死病毒，样品中含有该病毒。
[0014]相对于现有技术本发明的有益效果在于:本发明的LAMP引物组合物，可以快速检测样品中的传染性胰脏坏死病毒(IPNV)，该LAMP引物组合物只对IPNV进行特异性的扩增，与其他病毒并无交叉反应，对IPNV的特异性和灵敏度较常规PCR方法高。利用本发明的LAMP引物组合物检测IPNV，检测时间短，对IPNV的特异性和灵敏度高，所需检测仪器简单，能够快速、高效、准确检测传染性胰脏坏死病毒，适合口岸检验检疫机构和基层实验室推广。本发明的方法，为我国鱼类能够顺利出口欧盟、美国等国家及地区奠定基础，也为及时发现鱼病疫情隐患， 提高疫情预警和防控能力提供理论依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为利用本发明LAMP组合物在不同温度下进行的LAMP扩增反应结果的琼脂糖电泳图，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1-6依次为反应温度60°C、61°C、62°C、63°C、64°C和65°C时的LAMP扩增结果。
[0016]图2为利用本发明LAMP引物组合物在不同反应时间下进行的LAMP扩增反应结果的琼脂糖电泳图，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1_5依次分别为恒温反应30min、45min、60min、75min 和 90min 时的 LAMP 扩增结果。
[0017]图3为利用本发明LAMP引物组合物进行的LAMP扩增反应结果的检测结果，其中图3A是通过琼脂糖凝胶电泳判读的结果:在电泳图中泳道M为DL2000Marker，泳道I和2分别为IPNV样品和阴性对照；图3B是通过检测浊度变化判读的结果:从LAMP扩增反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪检测反应液，至扩增反应结束，图3B中横坐标I和2分别为IPNV样品和阴性对照。
[0018]图4为利用本发明LAMP引物组合物检测IPNV的特异性分析的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M为DL2000Marker,泳道1-5依次分别为IPNV、IHNV、SVCV、IPNV和ISA的RT-LAMP的扩增产物，泳道6为阴性对照。
[0019]图5为利用本发明LAMP引物组合物检测IPNV的灵敏度分析的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M为DL2000Marker，泳道1_8依次分别为反应体系中IPNV RNA含量1.0 μ g、
0.1 μ g、0.01 μ g、l.0ng、0.lng、0.01ng、0.01pg、0.0Olpg 时的扩增产物。
【具体实施方式】
[0020]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
[0021 ] 实施例1本发明LAMP引物组合物的设计和合成
[0022]根据Genbank IPNV基因组中编码A片段多聚蛋白的核苷酸序列(Genbank NO:AF342728.1),使用 Primer Explore V3 和 Primer Premier5.0 软件针对其中的 6 个区域(3，端的F3c、F2c、Flc以及5，端的B1、B2、B3)设计LAMP引物，对不同引物组进行LAMP扩增实验和检测分析，最终筛选出扩增速率高、特异性好的一组LAMP引物，分别为正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，其序列如表1。引物由大连宝生物工程有限公司合成。
[0023]表1.IPNV RT-LAMP 检测引物组
[0024]
【权利要求】
1.一种用于检测传染性胰脏坏死病毒的LAMP引物组合物，其特征在于，该LAMP引物组合物由序列为SEQ ID N0.1所示的正向内引物FIP、序列为SEQ ID N0.2所示的反向内引物BIP、序列为SEQ ID N0.3所示的正向外引物F3、序列为SEQ ID N0.4所示的反向外引物B3组成。
2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测传染性胰脏坏死病毒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤: (1)提取样品中的RNA； (2)以步骤(1)中提取的RNA为模板，进行RT-LAMP扩增反应； (3)对步骤(2)得到的LAMP扩增产物进行检测。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤(2)中RT-LAMP扩增反应条件为:60-65 °C下反 应30-90分钟，停止反应。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述RT-LAMP扩增反应条件为:62°C下反应60分钟，停止反应。
【文档编号】C12N15/11GK103937912SQ201410201046
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年5月13日 优先权日:2014年5月13日
【发明者】吴斌, 肇慧君, 张雪, 蔡晓萍 申请人:吴斌, 肇慧君, 张雪, 蔡晓萍