一种耐热、耐有机溶剂的烯醇还原酶及其生物催化用途
【专利摘要】本发明公开了一种来源于金黄杆菌CA49(Chryseobacterium?sp.CA49)的烯醇还原酶Chr-OYE3及其编码基因，并提供了该基因异源表达体系的构建方法以及基因产物烯醇还原酶Chr-OYE3用于碳碳双键不对称还原的方法。
【专利说明】一种耐热、耐有机溶剂的烯醇还原酶及其生物催化用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新的基因及其蛋白质产物，具体涉及了一种来源于金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)的新型烯醇还原酶Chr_0YE3及其在催化碳碳双键不对称还原中的应用，属于酶与生物催化【技术领域】。
【背景技术】
[0002]碳碳双键的不对称还原，可以同时得到含有一个或两个手性中心的光学纯化合物，成为合成手性材料的重要策略之一。属于老黄酶家族的烯醇还原酶(enoatereductase, ECl.3.1.31),能够催化带有强吸电子基团的烯烃化合物碳碳双键的不对称还原，并获得相应的光学纯烷烃化合物，因而被广泛用于手性烷烃化合物等手性材料的制备(Stuermer R, Hauer B, Hall M, Faber K.Asymmetric bioreduction of activated C=Cbonds using enoate reductases from the old yellow enzyme family.Currentopinion in chemical biology2007 ; 11:203-13)。烯醇还原酶广泛存在于微生物中，特别是细菌和低等真菌，在植物中也有相关发现(Toogood HS, Gardiner JM, ScruttonNS.Biocatalytic Reductions and Chemical Versatility of the Old Yellow EnzymeFamily of Flavoprotein Oxidoreductases.Chem Cat Chem2010 ;2:892-914),这为新型烯醇还原酶的发掘和利用提供了丰富的资源基础。
[0003]在工业合成中，某些相对严苛的反应条件(如高温，添加有机溶剂等)常被用来提高底物溶解性以及减少水溶液驱动的副反应进而提高合成效率。这些反应条件在一定程度上限制了烯醇还原酶酶催化的生物合成在工业上的应用，因而发掘高催化活力、高稳定性以及高立体选择性的新型烯醇还原酶资源具有重要的研究意义和应用价值。
【发明内容】
[0004]本发明公开了一种来源于金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)的烯醇还原酶Chr-0YE3及其编码基因，并提供了该基因异源表达体系的构建方法以及基因产物烯醇还原酶Chr-0YE3用于碳碳双键不对称还原的方法。
[0005]本发明所述的金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)从果园土壤中富集、分离并经过多轮筛选后获得。所述的金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)可以在中国典型培养物保藏中心获得，其保藏号为CCTCC M2012484 ;分类命名为金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)。在已公开的专利申请 201310399109.2 中已经保藏。
[0006]本发明首先提供一种烯醇还原酶Chr_0YE3，其核苷酸序列为如SEQ N0.1所示，其氨基酸序列为如SEQ N0.2所示。
[0007]本发明所述的烯醇还原酶Chr_0YE3的基因信息是通过对金黄杆菌CA49进行全基因组测序以及基因 功能注释所获得，并以金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)基因组DNA为模板，设计特异性引物，经PCR扩增获得该基因(具体方法见实施例1)。目标基因编码的蛋白质命名为烯醇还原酶Chr-0YE3。所述方法中PCR所用的引物如下，正向:5’ -GGATCC ATG TTA TAT ACT CCA GTT AAT TTC AG-3’(酶切位点:BamH I );反向:5’ -CTCGAG TTA AGA AGA TAT TTT TGC TCT CAG ATA C-3’(酶切位点:Xho I )。金黄杆菌 CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)的保藏编号为 CCTCC M2012484。
[0008]异源表达体系构建:将目标基因连入pET28a(+)，构建重组质粒pET28a_ChrOYE3，并转入大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，得到重组子E.coli(pET28a-ChrOYE3)。异源表达产物经镍柱纯化后得到纯酶。
[0009]根据公共知识，功能基因连接到各类载体，转入适当宿主细胞，在一定的条件下均可实现目的蛋白的过量表达。因此，烯醇还原酶Chr-0YE3的表达载体不局限于pET28a (+)，表达宿主也不局限于大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0010]本发明还提供了上述烯醇还原酶Chr_0YE3作为生物催化剂在不对称还原碳碳双键底物中的应用。优选的底物为:2-甲基-N-苯基-马来酰亚胺、2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4- 二酮或(Z) -3-硝基-2-苯基丙烯酸乙酯。
[0011]本发明所述的上述应用中，催化条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择。优选的催化体系为 :缓冲液，烯醇还原酶Chr-0YE3，底物，辅酶NADH(还原型辅酶I )或者NADPH(还原型辅酶II )。缓冲液包括但不限于下列缓冲液:柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，ρΗ4.5-6.5 ;磷酸钾缓冲液，ρΗ6.0-8.0 ；Tris - HCl，pH7.5-9.0 ;碳酸钠缓冲液，pH9.5。优选的反应温度:20-40°C。反应体系中的酶浓度、NADH或NADPH量，底物浓度等可以调整。为获得更高的转化效率，优选的辅酶NADH或者NADPH摩尔浓度等于或者大于底物的摩尔浓度。反应结束后，乙酸乙酯萃取终止反应，获得产物。
[0012]根据本领域公共知识，可进行上述生物催化反应的包括烯醇还原酶Chr_0YE3纯酶，重组菌休止细胞或者细胞破碎后的粗酶液或者冷冻干燥后的粗酶粉等其他形态。采用烯醇还原酶Chr-0YE3纯酶重组菌休止细胞作催化剂时，通常用辅酶循环底物代替辅酶进行反应，常用的辅酶循环底物为葡萄糖。
[0013]本发明的有益效果:烯醇还原酶Chr_0YE3具有良好的热稳定性和优异的有机溶剂耐受性，这些性质有利于生物催化中增加底物溶解性或减小水相体系中的副反应，还可能改善酶的催化性能，因此烯醇还原酶Chr-0YE3是一种具有重要应用潜力的新型生物催化剂备选资源。该酶催化2-甲基-N-苯基-马来酰亚胺、2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4- 二酮、(Z)-3-硝基-2-苯基丙烯酸乙酯的不对称还原，具有很高立体选择性，最高的e.e.值(对映体过量值)大于99%。
[0014]根据现有的公共知识，任何基因可改变其序列获得各种不同的突变体，这些突变体所表达的蛋白质往往具有相同的功能。本发明涉及基因及其产物也具有相同的特点。凡是SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经等位基因突变或者经添加、插入、缺失或/和取代一个或多个氨基酸且编码具有同等活性蛋白的氨基酸序列均属于本发明的保护范围。这些突变体同样能作为生物催化剂转化底物2-甲基-N-苯基-马来酰亚胺、2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4- 二酮、(Z) -3-硝基-2-苯基丙烯酸乙酯。
[0015]说明书附图
[0016]附图1为分离纯化浓缩后的烯醇还原酶Chr_0YE3蛋白质SDS-PAGE电泳图；
[0017]附图2为烯醇还原酶Chr-0YE3全酶以及游离辅酶300_600nm全光谱扫描曲线；
[0018]附图3为烯醇还原酶Chr_0YE3在不同温度下的热失活曲线；[0019]附图4为烯醇还原酶Chr_0YE3半失活温度曲线。
【具体实施方式】
[0020]以下所给出的实施例是为进一步说明本发明的技术特征，并非对本发明的技术方案进行限制。对本发明中的技术方案进行的任何修改或局部替换，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，均应涵盖在本发明的保护范围中。
[0021 ] 实施例1:烯醇还原酶Chr_0YE3的基因的扩增
[0022]根据金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)全基因组测序信息,得到数个烯醇还原酶序列，其中一个能够高选择性催化碳碳双键还原的酶为本发明的烯醇还原酶Chr-0YE3o 该酶 PCR 扩增时设计如下引物，if 向:5’ -GGATCC ATG TTA TAT ACT CCA GTTAAT TTC AG-3’(酶切位点:BamH I );反向:5’ -CTCGAG TTA AGA AGA TAT TTT TGC TCTCAG ATA C-3’(酶切位点:Xho I )。PCR扩增所用的模板为金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.CA49)基因组 DNA。
[0023]PCR程序为:95°C预变性 lOmin，94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，30 个循环，最后72°C延伸IOmin。
[0024]PCR产物以0.8%琼脂糖电泳分离，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段(天根生化科技北京有限公司)，而后将片段连入PMD19T载体(方法参考Takara公司TA克隆说明书)构建TA克隆，送至上海生工生物工程有限公司测序，得到正确的烯醇还原酶Chr-0YE3基因编码序列。
[0025]烯醇还原酶Chr_0YE3基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，该基因所编码的氨基酸序列序列为SEQ ID N0.2)与目前所报道的烯醇还原酶的氨基酸序列相似度相对较低，氨基酸序列相似性最高仅为51 %，证明本发明具有新颖性。下表为烯醇还原酶Chr-0YE3与同家族其他成员氨基酸序列比对结果。
[0026] 表1烯醇还原酶Chr_0YE3与其他老黄酶家族成员的氨基酸序列比对
[0027]
【权利要求】
1.一种烯醇还原酶Chr-0YE3，其特征在于，其核苷酸序列为如SEQ N0.1所示，其氨基酸序列为如SEQ N0.2所示。
2.权利要求1所述的烯醇还原酶Chr-0YE3作为生物催化剂在不对称还原碳碳双键底物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述底物为2-甲基-N-苯基-马来酰亚胺、2，6，6-三甲基-2-环己烯-1，4- 二酮或(Z) -3-硝基-2-苯基丙烯酸乙酯。
【文档编号】C12P17/06GK103966177SQ201410223172
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月23日 优先权日:2014年5月23日
【发明者】吴中柳, 徐梦宇, 裴小琼 申请人:中国科学院成都生物研究所