用于降解多环芳烃类有机污染物的无色杆菌菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于有机污染物的生物修复领域，具体公开了一种无色杆菌(Achromobacter?sp.)菌株W143，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC?NO：M2014154。本发明所公开的菌株对菲、萘、芴、荧蒽等有机污染物具有高效快速的降解能力。该菌株还具有广泛的pH值，盐度和温度适应能力，是对土壤或环境多环芳烃类有机污染物进行生物修复的优秀材料。
【专利说明】用于降解多环芳烃类有机污染物的无色杆菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属环境有机污染物修复治理领域。具体涉及一株用于降解多环芳烃类有机 污染物的无色杆菌菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 多环芳煙（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是一类含有两个或两个以 上苯环结构的有机物，因其在环境中广泛分布于海洋、湖泊和土壤中，并且水溶性低，不挥 发，结构稳定，而成为典型的持久性有机污染物。PAHs具有"致癌、致畸、致突变"效应，对环 境生态安全和人类健康具有极大的潜在危害。上个世纪八十年代以来，世界各国环保局都 已经将PAHs列为环境中优先监测污染物。环境中的PAHs主要来源于石油生产运输、石油炼 制、有机工业、化石能源燃烧、汽车尾气排放等；自然界的火山喷发，植物和微生物自身合成 和代谢也会导致部分PAHs的环境释放。其中石油是环境中PAHs的主要来源之一。石油中 含有复杂的PAHs混合物；柴油中含有约30-40%的PAHs ;杂酚油中的PAHs高达85-90%。 由于PAHs难溶或者不溶水，大多数环境中的PAHs会在环境迁徙过程中沉积到土壤中。土 壤中的PAHs主要来自大气沉降，污水灌溉，石油开采或泄露，以及工业污水或废弃物排放 等。土壤中的PAHs污染一方面将破坏土壤生态环境，影响土壤生产力，降低农作物产量；同 时导致农产品中PAHs积累，直接威胁人类身体健康。
[0003] 土壤的生物修复是利用生物尤其是微生物，将土壤中有毒有害的污染物矿化为二 氧化碳和水，或者转化为无害物质，恢复污染环境的生态功能的工程技术体系。生物修复已 经在石油污染治理，土壤有机农药去除，重金属污染治理以及氮磷营养调节等环境修复过 程中得到广泛运用。1972年美国利用生物修复技术清除宾西法利亚州的石油管线泄漏石油 是第一次成功运用生物技术进行土壤有机污染物修复，随后1989年美国环保局在阿拉斯 加的一处发生石油泄漏的海湾进行微生物菌剂投放，短时间内完成了泄漏石油的清除。自 1991年到1999年的10年间，美国采用生物修复技术完成了 104个严重污染区域的场地修 复，其中40%属于多环芳烃污染。我国中原油田地区采用微生物修复技术，结合植物修复和 物理化学方法，完成了 40多亩的石油污染区域的生物修复实践，其石油污染物降解率达到 85%，整理后的土地基本恢复耕地功能。
[0004] 微生物修复的实质是利用土壤微生物专一性代谢土壤中的有机污染物，将其转化 为细胞其它碳基大分子和二氧化碳的过程。因此实施和建立一套土壤有机污染物的微生物 修复工艺的核心是代谢速度快，环境适应性强的污染物降解菌的筛选和鉴定。由于生物安 全的原因，基因工程菌难以大面积运用于真实环境土壤的微生物修复，这使得从污染土壤 中分离获取的土著细菌成为最理想的微生物修复菌剂的候选材料。同时从土壤中分离获得 微生物还具有定植能力强，环境适应性广等特点，是开展生物修复的核心载体和污染物降 解的直接执行者。因此，筛选和鉴定具有有机污染物降解能力的微生物菌种资源是开展环 境有机污染物生物修复的如提和基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株用于降解多环芳烃类有机污染物的无色杆菌菌株及其 应用。
[0006] 申请人:从石油污染土壤中分离获得一株能够快速降解多环芳烃类污染物的菌株， 通过生理生化鉴定和核糖体16S rDNA基因序列分析将其鉴定为无色杆菌（Achromobacter sp.)菌株W143。该菌株已于2014年4月24日送交位于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大 学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC N0:M2014154。
[0007] 该菌株能够高效降解多环芳烃类有机污染物，尤其是菲、萘、芴、荧蒽等有机污染 物。
[0008] 本发明进一步提供一种降解多环芳烃类有机污染物的方法，该方法包括向被污染 的样品中接种所述的无色杆菌（Achromobacter sp.)菌株W143的步骤。
[0009] 优选地，还包括在接种后将样品的温度调节在16-37°c范围内的步骤。
[0010] 进一步优选地，还包括在接种后调节样品的PH值在3. 5-10范围内的步骤。
[0011] 最佳地，在接种后调节样品的PH值在5. 5-9范围内。
[0012] 本发明再进一步提供了一种用于降解多环芳烃类有机污染物的微生物菌剂，其活 性成分为所述的无色杆菌（Achromobacter sp.)菌株W143。
[0013] 本发明所提供的菌株对菲、萘、芴、荧蒽等有机污染物具有高效快速的降解能力， 该菌株具有广泛的pH值，盐度和温度适应能力，是对土壤或环境多环芳烃类有机污染物进 行生物修复的优秀微生物材料。
[0014] 更详细的技术方案见《具体实施方案》所述。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是菌株W143的革兰氏染色显微成像照片。
[0016] 图2是菌株W143对不同多环芳烃污染物的降解能力。图中NC为负对照、 Phenanthrene 为菲、naphthalene 为萘、Fluorene 为莉、Fluoranthrene 为突蒽、Biphenyl 为联苯、Pyrene为花、Benzo (a) pyrene为苯并花。
[0017] 图3是菌株W143在以菲为唯一碳源条件下的生长曲线和菲降解曲线。
[0018] 图4是菌株W143对钠离子浓度的敏感性曲线。
[0019] 图5是菌株W143对pH值的敏感性曲线。
【具体实施方式】
[0020] 以下结合实施例对本发明进行详细地说明。应该说明的是，本发明的实施例仅限 于对于本发明进行说明，而没有限制作用。实施例中所涉及的有关筛选方法、缓冲液配制和 常见培养基配方等可参照赵斌，何绍江主编的《微生物学实验》以及《分子克隆实验指南》 所描述的内容（参见J.萨姆布鲁克等，2002,分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等（译）， 科学出版社，北京）。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中 没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具 书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
[0021] 实施例1W143菌株的分离鉴定
[0022] 采用来自湖北潜江江汉油田长期受石油污染的土壤为筛选土壤，具体筛选方案 如下：
[0023] 1)取10g 土壤，加入到不含碳源的无机盐培养基MSM中，然后加入菲 (Phenanthrene)，使终浓度为100mg/L ;28°C震荡培养5天，再以5%的接量接到相应的新鲜 培养基中；连续转接5次；
[0024] 2)取0. 1ml的富集培养液，涂布到含有菲的MSM固体平板上，28°C静止培养5天 后，将平板上长出来的菌落转接到含有菲的平板上，继续培养生长；然后选择生长速度快的 菌落进行平板划线纯化；
[0025] 3)挑取稳定生长的菌落，接种到含有100mg/L的菲的MSM培养基中，28°C震荡培养 5天，获得本发明菌株。
[0026] 进一步对菌株进行了形态学和分子生物学鉴定。
[0027] 首先，对菌株的形态学特征进行了初步的观察，结果表明，该菌株为革兰氏阴性 菌，杆状（图1)。
[0028] 同时，发明人分离获得菌株的基因组DNA，然后以细菌16S rRNA基因的通用引 物27F和1492R引物对进行PCR扩增；将获得的PCR扩增产物进行测序，其序列如序列 表SEQ ID N0:1所示。然后，利用NCBI核酸数据库，根据菌株16S rRNA基因序列进行了 BLAST分析，结果表明菌株的16S rRNA基因序列与无色杆菌Achromobacter xylosoxidans A8, Achromobacter spanius strain LMG5911, Achromobacter denitrificans strain DSM30026，Achromobacter insolitus strain LMG6003 等多株细菌的 16S rRNA 基因序 列都具有99%的相似性，结合革兰氏染色和形态学观察，发明人将菌株命名为无色杆菌 (Achromobacter sp.)菌株 W143。
[0029] 实施例2W143菌株对多环芳烃的降解特征
[0030] 发明人对W143菌株对常见多环芳烃降解能力进行了研究。以不含有碳源的MSM培 养基为基础，分别添加不同的多环芳烃作为唯一碳源，使其终浓度为l〇〇mg/L ;然后以1% 的接种量接种处于对数生长期的W143培养物，置于28°C震荡培养5天后，测定培养物在 〇D_的吸光度值。以不添加任何碳源的培养基为负对照。由于培养基中未添加除多环芳 烃外的任何碳源，因此菌株的生长速度和生物量即体现了菌株对多环芳烃的利用和降解能 力。
[0031] 如图2所示，W143对菲具有最大利用能力，对萘、芴、荧蒽具有较强的降解能力；对 联苯、芘和苯并芘表现出较差的利用能力。这表明W143菌株同时对多种多环芳烃具有降解 能力。
[0032] 实施例3W143菌株对菲的降解特征
[0033] 为了进一步分析本发明所提供的W143菌株对多环芳烃的降解特征，发明人以菲 为唯一碳源，对W143菌株的生长速度和降解速度进行了测试。将处于对数生长期的W143 菌株以1%接种量接种到以500mg/L的菲为唯一碳源的MSM培养基中，置于28°C震荡培养。 同时，每12个小时测定一次培养物的0D_值和残留菲的浓度。
[0034] 如图3所示，W143菌从接种开始就具备了菲降解能力，并且在12小时后降解能 力和菌株生长都迅速增加，并且，随着培养物中残留菲浓度的减少，菌株生长逐渐进入平台 期。在接种W143菌株84小时时，培养物中的菲有95%被降解。这表明W143菌株具有快速 高效降解有机污染物菲的能力，能够将液体培养基中的500mg/L的菲在五天左右的时间内 完全降解。
[0035] 实施例4W143菌株的环境适应特征
[0036] 对W143菌株对温度、pH值和盐离子浓度的适应性进行了试验。
[0037] 采用R2A培养基，接种处于对数生长期的W143菌株到新鲜的R2A培养基中，接种 浓度为1% ;28°C震荡培养12小时后，取0. lml培养物涂布到R2A固体平板上，分别置于 4°C、16°C、20°C、25°C、30°C、37°C、42°C恒温培养箱中培养48小时，结果显示：W143菌株在 16°C，20°C，25°C，30°C，37°C中生长良好，且没有显著差异；不能在4°C和42°C条件下生长。 这表明W143菌株具有广泛的温度适应性，能够在不同季节和不同年平均温度下进行生长 和代谢。
[0038] 与上述培养条件相似，同样采用R2A培养基，分别利用MOPS，Tris. Cl，PBS将R2A 液体培养基的 pH 值调整为 3· 0、3· 5、4· 0、4· 5、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· 0、7· 5、8· 0、8· 5、9· 0、 9. 5、10. 0 ;然后接种新鲜的W143菌株到上述不同pH值的培养基中，28°C震荡培养24小时 后测定其〇D_，结果如图5所示：W143菌株在pH3. 5到pHIO范围内的生长都能够维持在最 大生长速度（PH7. 5)的60%以上，且pH5. 5到pH9的范围内，W143菌株的生长没有显著的 差异。这表明本发明所提供的W143菌株具有非常广泛的pH适应性，适合盐碱地及酸化环 境下生长和代谢。
[0039] 与上述上述培养条件相似，同样采用R2A培养基，在其培养基中添加 NaCl，使其终 浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10% ;然后接种新鲜的W143菌株到 上述不同钠离子浓度的培养基中，28°C震荡培养24小时后测定其0D_，结果如图4所示。 W143菌株在添加4%以内的钠离子的条件下其生长不受影响；添加钠离子浓度低于7%能 够维持不低于50%的生长，但是当在培养基中添加9%以上的钠离子的时候，W143将难以 维持有效的生长。这表明当采用W143进行有机污染物生物修复的时候，为了实现其菌株的 高效定植和维持其代谢活性，环境中有效的盐度应该控制在8%以内。
[0001] 序列表 <110〉华中农业大学 <120〉用于降解多环芳烃类有机污染物的无色杆菌菌株及其应用 <160> 1 <210> 1 <211> 1571 <212> DNA <213> 无色杆菌（tc?r 职）W143 <400〉 1 AGCGTGCAAG CTTGCATGCC TGCAGGTCGA CGATTAGAGT TTGATCCTGG GCTCAGATTG 60 AACGCTAGCG GGATGCCTTA CACATGCAAG TCGMCGGCA GCACGGACTT CGGTCTGGTG 120 GCGAGTGGCG AACGGGTGAG TAATGTATCG GAACGTGCCT AGTAGCGGGG GATMCTACG 180 CGAAAGCGTA GCTAATACCG CATACGCCCT ACGGGGGAAA GCAGGGGATC GCAAGACCTT 240 GCACTATTAG AGCGGCCGAT ATCGGATTAG CTAGTTGGTG GGGTAACGGC TCACCAAGGC 300 GACGATCCGT AGCTGGTTTG AGAGGACGAC CAGCCACACT GGGACTGAGA CACGGCCCAG 360 ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TGGGGAATTT TGGACAATGG GGGAAACCCT GATCCAGCC'A 420 TCCCGCGTGT GCGATGAAGG CCTTCGGGTT GTAAAGCACT TTTGGCAGGA AAGAAACGTC 480 ATGGGCTAAT ACCCCGTGAA ACTGACGGTA CCTGCAGAAT AAGCACCGGC TAACTACGTG 540 CCAGCAGCCG CGGTAATACG TAGGGTGCAA GCGTTAATCG GAATTACTGG GCGTAAAGCG 600 TGCGCAGGCG GTTCGGAAAG AAAGATGTGA AATCCCAGAG CTTAACTTTG GAACTGCATT 660 TTTAACTACC GAGCTAGAGT GTGTCAGAGG GAGGTGGAAT TCCGCGTGTA GCAGTGAAAT 720 GCGTAGATAT GCGGAGGAAC ACCGATGGCG AAGGCAGCCT CCTGGGATAA CACTGACGCT 780 CATGCACGAA AGCGTGGGGA GCAAACAGGA TTAGATACCC TGGTAGTCCA CGCCCTAGAC 840 GATGTCAACT AGCTGTTGGG GCCTTCGGGC CTTGGTAGCG CAGCTAACGC GTGAAGTTGA 900 CCGCCTGGGG AGTACGGTCG ΟΛΛΟΛΤΤΛΛΛ ACTCAAAGGA ATTGACGGGG ACCCGCACAA 960 GCGGTGGATG ATGTGGATTA ATTCGATGCA ACGCGAAAAA CCTTACCTAC CCTTGACATG 1020 TCTGGAATTC CGAAGAGATT TGGAAGTGCT CGCAAGAGAA CCCxGAACACA GGTGCTGCAT 1080
[0002] GGCTGTCGTC AGCTCGTGTC GTGAGATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT 1140 GTCATTAGTT GCTACGAAAG GGCACTCTAA TGAGACTGCC GGTGACAAAC CGGAGGAAGG 1200 TGGGGATGAC GTCAAGTCCT CATGGCCCTT ATGGGTAGGG CTTCACACGT CATACAATGG 1260 TCGGGACAGA GGGTCGCCAA CCCGCGAGGG GGAGCCAATC CCAGAAACCC GATCGTAGTC 1320 CGGATCGCAG TCTGCAACTC GACTGCGTGA AGTCGGAATC GCTAGTAATC GCGGATCAGC 1380 ATGTCGCGGT GAATACGTTC CCGGGTCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ATGGGAGTGG 1440 GTTTTACCAG AAGTAGTTAG CCTAACCGTA AGGGGGGCGA TTACCACGGT AGGATTCATG 1500 ACTGGGGTGA AGTCGTAACA AGGTAGCCGT AATCTCTAGA GGATCCCCGG GTACCGAGCT 1560 CGAATCGTAG A 1571
【权利要求】
1. 无色杆菌（Achromobacter sp.)菌株W143,保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏 编号为：CCTCC NO :M2014154。
2. 权利要求1所述的无色杆菌（Achromobacter sp.)菌株W143在降解多环芳经类有 机污染物中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述多环芳烃类有机污染物为菲、萘、芴、 荧蒽。
4. 一种降解多环芳烃类有机污染物的方法，包括向被污染的样品中接种权利要求1所 述的无色杆菌（Achromobacter sp.)菌株W143的步骤。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：还包括在接种后将样品的温度调节在 16-37°C范围内的步骤。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：还包括在接种后调节样品的PH值在 3. 5-10范围内的步骤。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：还包括在接种后调节样品的PH值在 5. 5-9范围内的步骤。
8. -种用于降解多环芳烃类有机污染物的微生物菌剂，其活性成分为权利要求1所述 的无色杆菌（Achromobacter sp.)菌株 W143。
【文档编号】C12N1/20GK104099266SQ201410223299
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年5月23日 优先权日:2014年5月23日
【发明者】陈雯莉, 黄巧云, 汪方奎, 李偲, 王少一 申请人:华中农业大学