用于检测与猪肉质相关的5-ht受体基因表达量的引物及检测方法
【专利摘要】本发明公开了用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的引物，包括（1）内参基因β-actin扩增引物；Forward:5'-TCTGGCACCACACCTTCT-3’；Reverse:5'-TGATCTGGGTCATCTTCTCAC-3’；（2）目的基因5-HT扩增引物；5-HT2A：Forward:5'-AGGTGCTGGGCATAGTCTT-3’；Reverse:5'-GACGGCTGAGGAGAGGTAAC-3’；5-HT7：Forward:5’-CAGATCAACTACGGCAGAGC-3’；Reverse:5’-GCAGACCGAAATCACCACCAG-3’。本发明还提供了检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的试剂盒以及荧光定量PCR方法。采用本发明的引物及差异模板浓度的荧光定量PCR检测方法，可实现不同组织中猪5-HT受体基因mRNA表达量的准确检测。
【专利说明】用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的引物及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量检测方法，属于农业生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]5-轻色胺受体(5-hydroxytryptamine receptor)是细胞膜上与5_轻色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)相结合的一类跨膜蛋白，隶属于G蛋白偶联受体超家族。它包括5-Η?\~5-ΗΤ7受体共7种类型，而多数类型又可细分为几个亚型。5-ΗΤ作为第一信使，与相应受体结合后，激活或抑制跨膜蛋白-腺苷酸环化酶(AC)的活性，从而增加或减少了胞内环腺苷酸(cAMP、第二信使)的浓度，进而影响蛋白质、糖和脂肪代谢，发挥其生理作用。之后，5-HT通过5-羟色胺转运体被转运到细胞内灭活，以免发生中毒反应及受体的脱敏。研究发现，5-HT及其受体在动物体生理过程中发挥着极其重要的作用，主要是调控中枢神经系统和胃肠道的功能，影响动物的行为情绪和消化吸收(Pytliak et al.,2011 ；Blessing et al.，2003)。同时，通过第二信使cAMP的调控，对猪的生长和肉质也会产生影响(Hoyer et al., 1994 ;杨在清等,1992 ;王丽,2009)。
[0003]随着现代人民生活水平的提高，对优质猪肉的需求渐益旺盛，肉质差异的机理和应用性研究倍受重视。我国地方猪种通常与外来快大猪种存在着明显差别，地方猪温顺、母性强，肉质细嫩、鲜美；而外来猪长速快、瘦肉率高，但肉质相对粗糙。关于这其间肉质差异的分子机理研究已有不少，例如，Naveau (1986)、Gustavsson (1992)和Serge (1993)等发现，氟烷基因和RN基因是影响肉品质的主效基因，氟烷基因的表达调控导致了 PSE肉的产生；RN基因则使肌肉pH值下降，从而产生酸肉。除此之外，Gerbens等(1998)研究发现，影响肉品质的候选基因还有脂肪酸结合蛋白基因(FABP)，其表达调控主要影响肌内脂肪(IMF)含量；邓桂馨等(2007)发现，钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)和MyoD基因可调控肌纤维类型及其含量，从而决定肉的质地、嫩度。但是，5-HT受体基因与肉质的相关性研究尚未见报道。5-HT受体主要分布于脑、小肠和血管等组织，在其他组织中也有一定的表达。例如，5-HT2A、5-HT7受体在子宫及胃肠道等高表达组织已得到检测，并发现其作为兴奋型受体，具有收缩子宫的作用，但在肌肉等表达量较低的组织中难以实现准确检测(Sumner etal., 2008 ；Nakamura et al., 2008)。
[0004]本发明研究提供了猪5-HT受体基因的定量检测方法，可对猪肌肉、脂肪等肉质相关组织的5-HT受体基因的表达进行分析，操作相对简便，检测灵敏度高、准确性强。通过猪5-HT受体基因的定量检测，有助于进一步了解该基因的组织表达模式，判析其与肉质的相关性，从而挖掘具有生产应用价值的肉质相关基因，为今后猪的育种工作提供更多辅助手段。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于通过对不同品种猪、不同组织中5-HT受体基因表达量的检测分析，提供一种用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的引物、试剂盒及荧光定量PCR方法。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0007]用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的引物，其特征在于所述引物包括:
[0008](I)内参基因β-actin扩增引物；
[0009]Forward: 5' -TCT GGC ACC ACA CCT TCT-3，；
[0010]Reverse: 5，-TGA TCT GGG TCA TCT TCT CAC—3，；
[0011](2)目的基因5-HT扩增引物；
[0012]5-HT2A =Forward: 5’ -AGG TGC TGG GCA TAG TCT T_3，；
[0013]Reverse: 5’ -GAC GGC TGA GGA GAG GTA AC-3，；
[0014]5-HT7 =Forward: 5，-CAG ATC AAC TAC GGC AGA GC-3，；
[0015]Reverse: 5，-GCA GAC CGA AAT CAC CAC CAG-3，。
[0016]本发明还提供了包含上述扩增引物的试剂盒，可用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量。
[0017]用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的试剂盒，其特征在于包括以下组成:
[0018](I)内参基因β-actin扩增引物;
[0019]Forward: 5，-TCT GGC ACC ACA CCT TCT-3，；
[0020]Reverse: 5，-TGA TCT GGG TCA TCT TCT CAC-3，；
[0021](2)目的基因5-HT扩增引物；
[0022]5-HT2A =Forward: 5’ -AGG TGC TGG GCA TAG TCT T_3，；
[0023]Reverse: 5’ -GAC GGC TGA GGA GAG GTA AC-3，；
[0024]5-HT7:Forward: 5，-CAG ATC AAC TAC GGC AGA GC-3，；
[0025]Reverse: 5，-GCA GAC CGA AAT CAC CAC CAG-3，；
[0026](3)荧光定量PCR反应液；
[0027](4)双蒸水。
[0028]本发明最后提供了一种利用上述试剂盒检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的荧光定量PCR方法。
[0029]检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的方法，其特征在于包括步骤:
[0030](I)Trizol法提取猪肉不同组织样本的RNA，并反转录为cDNA ；
[0031](2)以步骤(1)制得的cDNA为模板原液，取部分原液倍比稀释获得不同浓度的cDNA模板稀释液，分别用5-HT受体基因和β-actin内参基因引物，进行实时荧光定量PCR扩增；
[0032]所述内参基因β-actin扩增引物为:
[0033]Forward: 5，-TCT GGC ACC ACA CCT TCT-3，；
[0034]Reverse: 5，-TGA TCT GGG TCA TCT TCT CAC-3，；
[0035] 所述5-HT受体基因扩增引物为:[0036]5-HT2A =Forward: 5’ -AGG TGC TGG GCA TAG TCT T_3 ’ ；
[0037]Reverse: 5’ -GAC GGC TGA GGA GAG GTA AC-3，；
[0038]5-HT7:Forward: 5，-CAG ATC AAC TAC GGC AGA GC-3，；
[0039]Reverse: 5，-GCA GAC CGA AAT CAC CAC CAG-3，；
[0040]其中，PCR反应程序:94°C 5sec，60°C 40sec，40个循环；最后72°C延伸5min ;绘制熔解曲线；
[0041](3)利用2_Λ 法计算得到目的基因的表达量，计算公式为:基因表达量=2~_((#
品的目的基因平均Ct3-内参基因平均Ct4)-(校样品的目的基因平均CU-内参基因平均Ct2))
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[0042]采用本发明的引物及差异模板浓度的荧光定量PCR检测方法，可实现不同组织中猪5-HT受体基因mRNA表达量的准确检测。根据5-HT在组织中的表达量，选择合适的模板浓度，控制检测到的Ct值在准确的范围内。减少循环数少基底值的影响，及多循环数后异源二聚体等无效扩增的干扰，具有较高的特异性、敏感性，使相对定量计算结果更准确，提高了 5-HT的检测准确性。本方法操作无需构建标准曲线，简便快速，可重复性好，检测效率高。通过5-HT受体基因与不同品种猪、不同组织肉质的相关分析，有助于挖掘我国地方猪种的资源特色，为猪育种实践提供科学依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1是目的基因5-HT2A熔解曲线。
[0044]图2是目的基因5-HT2A标准曲线。
[0045]图3是目的基因5-HT7熔解曲线。
[0046]图4是目的基因5-HT7标准曲线。
[0047]图5是内参基因熔解曲线
[0048]图6是内参基因标准曲线
[0049]图7是5-HT受体基因及内参基因PCR扩增片段琼脂糖电泳图。
【具体实施方式】
[0050]以下结合附图和实施例进一步说明本发明。
[0051]实施例1 5-HT受体基因检测方法及其优化
[0052]I实验仪器与材料
[0053]实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad 0PTIC0N2，美国);超低温冰箱(Thermo，美国);高速冷冻离心机(Eppendorf5417R，德国);梯度PCR仪(ABI PCR system9700，美国);可调式微量移液器(Eppendorf，德国)；GEL EQ电泳凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)；紫外可见分光光度计(BioSpec-nano,日本)。
[0054]2 RNA提取及反转录
[0055]用Trizol法提取各组织总RNA。RNA样品经1.4%琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检测，保证RNA样品质量可靠，并计算样品总RNA浓度。取2~4 μ g总RNA，按照Promega M-MLV反转录试剂盒(Promega,美国)的使用说明，合成cDNA第I链。
[0056]3引物设计
[0057]根据组织样特点，选取三种常用内参基因β -actin、GAPDH、HPRT设计引物；同时针对目的基因5-HT2A、5-HT7不同区段序列分别设计3对扩增引物。各对引物的详细信息见表1。
[0058]表1引物信息
[0059]
【权利要求】
1.用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的引物，其特征在于所述引物包括: (1)内参基因β-actin扩增引物；
Forward: 5’ -TCT GGC ACC ACA CCT TCT-3’ ；
Reverse: 5’ -TGA TCT GGG TCA TCT TCT CAC—3，； (2)目的基因5-HT扩增引物；
5-HT2A:Forward: 5’ -AGG TGC TGG GCA TAG TCT T_3’ ；
Reverse: 5’ -GAC GGC TGA GGA GAG GTA AC-3’ ；
5-HT7:Forward: 5’ -CAG ATC AAC TAC GGC AGA GC-3’ ；
Reverse: 5’ -GCA GAC CGA AAT CAC CAC CAG-3’。
2.用于检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的试剂盒，其特征在于包括以下组成: (1)内参基因β-actin扩增引物；
Forward: 5’ -TCT GGC ACC ACA CCT TCT-3’ ；
Reverse: 5’ -TGA TCT GGG TCA TCT TCT CAC—3，； (2)目的基因5-HT扩增引物；
5-HT2A:Forward: 5’ -AGG TGC TGG GCA TAG TCT T_3’ ；
Reverse: 5’ -GAC GGC TGA GGA GAG GTA AC-3’ ；
5-HT7:Forward: 5’ -CAG ATC AAC TAC GGC AGA GC-3’ ；
Reverse: 5’ -GCA GAC CGA AAT CAC CAC CAG-3’ ； (3)荧光定量PCR反应液； (4)双蒸水。
3.检测与猪肉质相关的5-HT受体基因表达量的方法，其特征在于包括步骤: (1)Trizol法提取猪肉不同组织样本的RNA，并反转录为cDNA； (2)以步骤(1)制得的cDNA为模板原液，取部分原液倍比稀释获得不同浓度的cDNA模板稀释液，分别用5-HT受体基因和β-actin内参基因引物，进行实时荧光定量PCR扩增； 所述内参基因β-actin扩增引物为:
Forward: 5’ -TCT GGC ACC ACA CCT TCT-3’ ；
Reverse:5’ -TGA TCT GGG TCA TCT TCT CAC—3，； 所述5-HT受体基因扩增引物为:
5-HT2A:Forward: 5’ -AGG TGC TGG GCA TAG TCT T_3’ ；
Reverse: 5’ -GAC GGC TGA GGA GAG GTA AC-3’ ；
5-HT7:Forward: 5’ -CAG ATC AAC TAC GGC AGA GC-3’ ；
Reverse: 5’ -GCA GAC CGA AAT CAC CAC CAG-3’ ； 其中，PCR反应程序:94°C 5sec，60°C 40sec，40个循环；最后72°C延伸5min ;绘制熔解曲线； (3)利用计算得到目的基因的表达量，计算公式为:基因表达量=的基因平均Ct3-内参基因平均Ct4)-(校样品的目的基因平均CU-内参基因平均Ct2))
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【文档编号】C12Q1/68GK104004843SQ201410234884
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】王欢欢, 章学东, 李庆海, 楼立峰, 张雷 申请人:杭州市农业科学研究院