基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法，本发明本发明针对ORF1基因就PCV1和PCV2的ORF1阅读框同源性高达86%进行核酸疫苗研究，可刺激动物机体产生相应高水平的抗体，体现出很强的特异性，针对PCV1和PCV2引发猪的感染和传播，通过两种病毒类似的阅读框对两种病毒起到防控效果，可达到安全和有效的效果。
【专利说明】基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其是一种基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV)为圆环病毒科（Circoviridae)圆环病毒 属成员，单股环状DNA病毒，为已知的最小动物病毒之一。根据基因组和抗原性的差异，分 为PCVl和PCV2两种基因型（或血清型），其中PCVl至今未发现有致病性，PCV2则被认定 是导致仔猪断奶后多系统衰竭征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS) 的主要病原。PCV2常与细小病毒（PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)、猪肺炎支原 体、伪狂犬病毒（PRV)混合感染，造成猪的免疫失败。PCVl和PCV2的基因组包含有2个主 要的开放阅读框，即ORFl和0RF2,病毒的主要结构蛋白由0RF2编码，ORFl基因编码Rep和 较小的^两种与复制有关的蛋白。将体外表达的ORFl编码蛋白与表达粒细胞-巨噬细 胞集落刺激因子（GM2CSF)的真核表达质粒联合免疫猪群，能起到抵抗PCV2攻击的作用，这 提示针对ORFl基因编码蛋白的抗体可能具有中和病毒的作用。PCVl与PCV2的ORFl阅读 框同源性高达86%，目前大多数报道称PCVl无致病性，但已有报道称其可引起繁殖障碍，猪 圆环病毒的免疫程序已经很成熟，但其带来的经济损失却持续增加，可以很好的解释PCVl 的存在对PCV2的致病性有促进作用。
[0003] 目前，国内外对于PCV2基因工程疫苗包括PCV2亚单位疫苗和重组PCV2活载体疫 苗。Cap蛋白是PCV2的主要结构蛋白和免疫保护性抗原，能刺激动物机体产生针对PCV2 的特异性免疫应答，是研制PCV2基因工程亚单位疫苗的理想靶抗原。常用于PCV2亚单位 疫苗生产的表达系统主要是昆虫细胞杆状病毒表达系统。其中重组PCV2活载体疫苗又包 括PCV2病毒活载体疫苗和PCV2细菌活载体疫苗。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是：提供一种基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法，它所制备或的 疫苗能有效预防PCVl及PCV2的感染与传播，可达到很好的免疫效果，而不产生致病性，并 体现出很强的特异性，以克服现有技术的不足。
[0005] 本发明是这样实现的：基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法，包括如下步骤 1) 将猪圆环病毒II型ORFl基因进行PCR扩增，猪圆环病毒II型ORFl基因具有如序列 表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，扩增条件为：PCR体系总体积50 μ L，其中CldH2O 为 37 μ L，IOXPCR Buffer 5 μ L，dNTP LO μ L，上下游引物各 LO μ L，DNA 模板 4.0 μ L， Taq酶1.0 yL;扩增程序为：94°C预变性3min;94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸 I. 5min，共进行30个循环；最后延伸72°C IOmin ;上游引物的序列为Primer F 5' -CGGGT ACCATGCCCAGCAAGAAGAATG-3'，下游引物的序列为 PrimerR 5' -GGCCCGGGTCAGTAAITTAITT CATATGGAA-3;； 2) 将扩展获得的PCR产物与pMD18-T载体连接，将连接产物转化入大肠埃希氏菌DH5a 感受态细胞，在37°C下培养12 h，挑取上述白色菌落，接种到含有氨苄青霉素的2XYT液体 培养基中，在37°C振荡培养过夜至混浊，提取质粒并进行酶切鉴定； 3) 将重组质粒PMD18-0RF1与pEGFP-Cl载体分别进行KpnI和XmaI双酶切，回收纯化 目的片段，将二者用T4 DNA连接酶于16°C连接过夜，连接产物转化至大肠埃希氏菌DH5a 感受态细胞，用试剂盒提取质粒并进行KpnI和XmaI双酶切，用试剂盒提取获得阳性重组质 粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1，并进行双酶切及PCR鉴定； 4) 真核构建体系为：目的DNA片段8yL、pEGFP-Cl 2yL、T4 DNA ligase0.5yL、10XT4 DNA ligase buffer I. 5 μ L、灭菌 ddH20 3· O μ L，总体积 15. O μ L ; 5) 培养并收获处于指数生长期的ΡΚ-15细胞，用胰蛋白酶消化后用6 mL营养液悬浮细 胞；然后取6孔细胞培养板，加 I mL上述细胞悬液和I mL生长液，放入37°C 5%C02恒温 培养箱培养24 h，使细胞达709Γ80%融合时进行转染，参照Lipofecttamine TM2000试剂说 明书进行重组质粒pEGFP-Cl- PCV2- ORFl转染试验；在培养箱中培养48h，检测转染水平， 同时设置转染空质粒pEGFP-Cl和不转染质粒的细胞作为对照。
[0006] 6)经扩增培养后，获得的pEGFP-Cl- PCV2- ORFl质粒作为基于猪圆环病毒核酸疫 苗。
[0007] 本发明将针对PCVl的存在对PCV2的致病性有促进作用这一问题设计了疫苗，用 于预防并控制PCVl和PCV2对猪的感染，适用于对猪的免疫，为猪圆环病毒病的防治提供安 全有效的免疫产品，并减少对养猪业带来的经济损失。本发明安全性好，针对猪圆环病毒其 中一个重要的阅读框展开研发，通过对猪制定合理的免疫程序，从而达到对猪圆环病毒病 的预防与控制，可达到很好的免疫效果，而不产生致病性；本发明针对ORFl基因就PCVl和 PCV2的ORFl阅读框同源性高达86%进行核酸疫苗研究，可刺激动物机体产生相应高水平的 抗体，体现出很强的特异性；本发明针对PCVl和PCV2引发猪的感染和传播，通过两种病毒 类似的阅读框对两种病毒起到防控效果，有很好的科学性。
【专利附图】
【附图说明】 附图1为本发明的流程图。
【具体实施方式】
[0008] 本发明的实施例：基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法： 真核表达质粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、无内毒素质粒 抽提相关试剂等。
[0009] 包括如下步骤： 第一，引物的设计及合成 引物经登录661161^111^(?^￥.11(313；[.111111.11；[11.80￥)获取3/?-321株（登录号疋11747085)、 Vos_2689006 株（登录号：EUM555I)、Ρ701-1 株（登录号：FJ905468)、PCV2_HZ0 20l 株（登 录号：AY-188355)和PCV2herd D株（登录号：EU136720)序列，以Bioedit软件比对选取保 守序列后经Primer Premier 5软件设计猪圆环病毒II型ORFl基因（具有如序列表中SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列)通用引物；上游引物的序列为Primer F 5' -CGGGTACCATGCCC AGCAAGAAGAATG-3，，下游引物的序列为 PrimerR 5' -GGCCCGGGTCAGTAAITTAITTCATATGGAA _3' ； 第二，最佳反应体系的确定 PCR 体系总体积 50yL，其中 ddH20 37yL，10XPCR Buffer 5yL，dNTP LOyL，上下 游引物各I. 0μ L，DNA模板4. 0 μ L，Taq酶I. 0 μ L。扩增程序为：94°C预变性3min ;94°C 变性45s，55°C退火45s，72°C延伸1.5min，共进行30个循环；最后延伸72°C IOmin; 第三，最佳反应体系的确定 在50. 0 μ L的反应体系中，设定不同的引物浓度各0· 4pmol/ μ L、0. 6pmol/ μ L、 0· 8pmol/ μ L、I. 2pmol/ μ L、I. 6pmol/ μ L，不同的 dNTP 浓度 0· 2nmol/ μ L、0. 3nmol/ μ L、 0· 4nmol/ μ L、0. 5nmol/ μ L、0. 6nmol/ μ L，以最适退火温度对 Mycoplasma mycoides cluster与Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因部分序列克隆质粒等量混合模板进 行扩增，以确定最佳的反应体系； 第四，PCV2-0RF1基因的克隆 PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，切下含目的条带的凝胶，参照DNA胶回收试剂盒 说明书回收PCR产物，用常规方法与PMD18-T载体连接；将连接产物转化入大肠埃希氏菌 DH5a感受态细胞，37°C培养12 h，挑取上述转化平皿中的白色菌落，接种到含有氨苄青霉 素的2 X YT液体培养基中，37°C振荡培养过夜至混浊，提取质粒并进行酶切鉴定，筛选出阳 性并进行测序； 第五，真核质粒pEGFP-Cl- PCV2- ORFl的构建 重组质粒PMD18-0RF1与pEGFP-Cl载体分别进行KpnI和XmaI双酶切，回收纯化目的 片段，将二者用T4 DNA连接酶于16°C连接过夜，连接产物转化至大肠埃希氏菌DH5a感受 态细胞，试剂盒提取质粒并进行KpnI和XmaI双酶切，酶切正确，试剂盒提取获得阳性重组 质粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1，进行双酶切及PCR鉴定，并送公司测序验证。其中真核构建 体系为：目的 DNA 片段 8yL、pEGFP-Cl 2yL、T4 DNA IigaseO. 5μ L、10XT4 DNA Iigase buffer I. 5 μ L、灭菌 ddH20 3· 0 μ L，总体积 15. 0 μ L ; 第五，真核质粒pEGFP-Cl- PCV2- ORFl体外培养 培养并收获处于指数生长期的PK-15细胞，用胰蛋白酶消化后用6 mL营养液悬浮细 胞。然后取6孔细胞培养板，加 I mL上述细胞悬液和I mL生长液，放入37°C 5% C02恒温 培养箱培养24 h，使细胞达709Γ80%融合时进行转染。参照Lipofecttamine TM2000试剂 说明书进行重组质粒pEGFP-Cl- PCV2- ORFl转染试验。在培养箱中培养48h，检测转染水 平，同时设置转染空质粒pEGFP-Cl和不转染质粒的细胞作为对照； 第七，基于猪圆环病毒核酸疫苗的研究及应用，动物性实验如下： (1) 经扩增培养pEGFP-Cl- PCV2- ORFl后，制备大量无内毒素的pEGFP-Cl- PCV2-ORFl质粒，免疫小白鼠，监测小白鼠血清中PCV2-0RF1特异性抗体水平； (2) 5-6周龄小白鼠(购自贵阳医学院）随机分成3组，分别为生理盐水空白组， pEGFP-Cl- PCV2- ORFl真核质粒试验组，pEGFP-Cl空质粒试验组； (3) 免疫程序为：相同部位肌肉注射，在首免前2d注射0. 25%普鲁卡因100 μ 1/只，每 组质粒免疫剂量为100 μ g/只，于首免后间隔I4d加免一次； (4) 分别于首免后0、7、14、21、28、35d小鼠血清，用已建立的间接ELISA法测定血清中 ORFl抗体的水平；其中所建立的间接ELISA法抗原包被最佳浓度1. 5 μ g/ μ 1，血清最佳稀 释度为1:10,二抗最佳工作浓度为1:1000 ; (5)PCV2-0RF1抗体阳性判定值为0. 231，pEGFP-Cl- PCV2- ORFl真核质粒刺激小鼠机 体产生抗体水平出现很高的阳性水平； 第八，临床应用 pEGFP-Cl- PCV2- ORFl质粒接种免疫猪，监测其刺激猪产生的抗体水平，以验证方法 的临床应用性； 通过第一至第七步骤的比较及验证，证实基猪圆环病毒核酸疫苗的研究及应用确实能 使小鼠机体产生抗猪圆环病毒的高抗体水平。
[0010] pEGFP-Cl- PCV2- ORFl真核质粒刺激小鼠机体产生抗体水平出现很高的阳性水 平，如表1 : 表1抗体检测结果
【权利要求】
1. 一种基于猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤 1) 将猪圆环病毒II型0RF1基因进行PCR扩增，猪圆环病毒II型0RF1基因具有如序 列表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，扩增条件为：PCR体系总体积50 y L，其中ddH20 为 37 ii L，10XPCR Buffer 5 ii L，dNTP 1. 0 ii L，上下游引物各 1. 0 ii L，DNA 模板 4. 0 ii L， Taq酶1.0 iiL;扩增程序为：94°C预变性3min;94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸 1. 5min，共进行30个循环；最后延伸72°C lOmin ;上游引物的序列为5' -CGGGTACCATGCCC AGCAAGAAGAATG-3，下游引物的序列为 5' -GGCCCGGGTCAGTAAITTAITTCATATGGAA-3，； 2) 将步骤1)中获得的PCR产物在质量百分比为1%的琼脂糖凝胶中电泳，切下含目的 条带的凝胶，用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，将PCR产物与pMD18-T载体连接，将连接 产物转化入大肠埃希氏菌DH5 a感受态细胞，在37°C下培养12 h，挑取上述白色菌落，接种 到含有氨苄青霉素的2XYT液体培养基中，在37°C振荡培养过夜至混浊，提取质粒并进行 酶切鉴定； 3 )将重组质粒PMD18-0RF1与pEGFP-Cl载体分别进行Kpnl和Xmal双酶切，回收纯化目 的片段，将二者用T4 DNA连接酶于16°C连接过夜，连接产物转化至大肠埃希氏菌DH5a感 受态细胞，用试剂盒提取质粒并进行Kpnl和Xmal双酶切，用试剂盒(具体用什么试剂盒？） 提取获得阳性重组质粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1，并进行双酶切及PCR鉴定； 4) 真核构建体系为：目的DNA片段8iiL、pEGFP-Cl 2iiL、T4 DNA ligase0.5iiL、10XT4 DNA ligase buffer 1. 5 u L、灭菌 ddH20 3. 0 u L，总体积 15. 0 u L ; 5) 培养并收获处于指数生长期的PK-15细胞，用胰蛋白酶消化后用6 mL营养液悬浮细 胞；然后取6孔细胞培养板，加1 mL上述细胞悬液和1 mL生长液，放入37°C浓度为5%的C02恒温培养箱培养24 h，使细胞达709T80%融合时进行转染，采用Lipofecttamine TM2000试 剂进行重组质粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1转染试验；在培养箱中培养48h，检测转染水平； 6) 将pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1经扩增培养后，获得的pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1质粒作为 基于猪圆环病毒核酸疫苗。
【文档编号】C12N15/66GK104353084SQ201410234838
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】王开功, 郭颖初, 周碧君, 文明, 程振涛 申请人:贵州大学