Nras基因突变检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种NRAS基因突变检测试剂盒，该试剂盒可用于检测与癌症有关的NRAS基因突变。所述试剂盒包含：(1)内参检测试剂，其包含内参基因特异性引物、内参基因特异性探针及dNTP溶液；(2)NRAS突变检测试剂，其包含NRAS基因突变型特异性引物、NRAS基因突变型特异性探针、内控基因特异性引物、内控基因特异性探针及dNTP溶液；(3)Taq DNA聚合酶；和(4)NRAS阳性质控品。
【专利说明】NRAS基因突变检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因突变检测。具体地说，本发明涉及NRAS基因突变检测试剂盒，该 试剂盒可用于检测与癌症有关的NRAS基因突变。
【背景技术】
[0002] Ras基因是一种原癌基因，最初从Harvey, Kirsten大鼠肉瘤病毒（rat sarcoma) 中克隆所得，被称为HRas和KRas[1]。后来将人神经母细胞瘤DNA感染NIH3T3细胞时发现 另一种相似的基因，被称为NRas，三者是Ras基因家族最主要的成员 [2]。功能上Ras蛋白 具有分子开关的作用，正常表达下，能够调控细胞生长。发生点突变，过表达或者基因易位 等异常情况会导致细胞异常增殖，并最终引发肿瘤形成，超过30%的人类肿瘤存在Ras的 突变 [3'4]。现在研究最为深入的是KRas，其过表达和突变普遍发生在甲状腺癌，乳腺癌等很 多癌症中，在北美肺腺癌患者中，其突变率更是高达25%。并且KRas还与TKI耐药有关，所 以它成为很多肿瘤诊断和治疗的分子标志，在临床上发挥了重要意义 [5'6]。作为Ras家族的 另一成员，NRas在结构和功能上都与KRas具有很多相似性，并随着近年研究的加深，逐渐 成为继KRas之后另一个为临床病情评估和治疗提供重要依据的分子指标。
[0003] NRas基因位于人类1号染色体短臂上（1ρ22-ρ32)，编码具有189个氨基酸p21 蛋白 [7]。NRas蛋白与Ras家族其他蛋白具有高达85%同源性，这些高度保守的结构域包 括对蛋白功能发挥起着极其重要作用的鸟苷三磷酸（guanosine triphosphate, GTP)和 效应分子的结合域以及将NRas蛋白定位于质膜上的法尼基转移酶作用位点-C端的CAAX 基序等[8'9]。所以功能上NRas也具有很多RAS家族蛋白共同的特征：位于细胞膜内侧，属 于一种低分子量G蛋白，对鸟苷酸具有很强的亲和性并具有GTPase活力；具有GTP结合 (Ras. GTP)及⑶P结合（Ras.⑶P)两种构象，在一定条件下二者可以发生互变；当Ras蛋 白与GDP结合时为失活状态，与GTP结合时，为活化状态，激活下游信号通路，由此在信号 传导中起着极为重要的开关作用 [1°'11]。NRAS激活的下游信号通路也是现在研究最为明确 的 RAS 信号通路：PTK (protein tyrosine kinase) -Grb2 (growth factor receptor-bound protein2)-Ras-Raf-MAPK(mitogen activated protein kinase)-ERK(extracellular signal-regulated kinase)通路[12]。当外源刺激如生长因子（EGF)等与胞膜受体（EGFR) 结合，使受体上相应的酪氨酸激酶磷酸化，磷酸化的酪氨酸残基与Grb2的SH2区结合后，招 募鸟氨酸交换因子（S0S)与Grb2的SH3区结合形成复合物Grb2-S0S，该复合物与Ras结合 并使Ras-GDP转变为Ras-GTP，从而激活Ras。激活后的Ras再激活下游Raf激酶，Raf激 酶磷酸化ΜΑΡΚ，MAPK激活ERK。ERK被激活后，转至细胞核内，直接激活c-myc各种转录因 子，从而参与细胞生长，发育，分裂及分化等多种生理过程 [13]。当NRas发生突变时，会导致 下游Raf以及MAPK等的异常激活从而在肿瘤恶变中起重要作用[14]。
[0004] Ras蛋白的突变主要发生在第12,13, 59和61位密码子上，其中12,61位突变频 率最高[15]。在不同癌症中，突变类型不一样，非小细胞肺癌中，主要的突变为第12位密码 子中的鸟嘌呤被胸腺嘧啶取代，而在结肠癌中同一位置主要是鸟嘌呤被腺嘌呤取代 [16]。 NRas突变主要发生在第61位密码子，并且在黑色素瘤中频率较高。Thoams等人利用突变 (mutation)和黑色素瘤（melanoma)为关键词在pubmed中检索分析了 1966年-2006年发 表的文章，发现在表面扩散和结节性黑色素瘤中NRas的突变率高达28% [17]。Vikas等人在 60例原发性黑色素瘤中检测到10例（17%，10/16) NRas的突变，且这些突变全部为61位密 码子的突变[18]。非常值得关注的是，近年NRas已被确认为肺癌发生的驱动基因。Kris等 在 2011 年 ASC0 上发表了来自 LCMC (NCI ' s Lung Cancer Mutation Consortium)的一项研 究，对1000例肺腺癌标本中KRas，EGFR，NRas等10种驱动基因进行检测，全部患者为Illb 期/IV期，并且有足够的组织标本。研究共入组830例患者，60%患者有驱动基因突变，其 中NRas的突变率为0. 2% [19'2°]。
[0005] 由于Ras突变对肿瘤的影响大多集中在Ras/Raf/MEK/ERK通路上，所以现在针对 Ras突变的靶向抗肿瘤药物主要集中在对该信号通路中的不同节点的靶向干预上。已开发 的药物包括对Ras膜结合和脂质修饰进行干扰的法尼基转移酶抑制剂（FTIs)，如替吡法尼 (tipifarnib)等[ 21]，针对Raf活化的ATP间接竞争剂索拉菲尼（sorafenib) [22'23]，针对MEK 靶向干预的CI-1040和AZD6244,其中后者已经进入临床试验[24]。由于ERK是目前所知的 MEK唯一的底物，通常被描述为Ras下游的单一通路，所以人们一般认为只要在MEK靶点进 行抑制就等于阻断了变异Ras引起的ERK的活化，还可以避免其他通路干扰所导致的无效 革巴向影响 [9]。
[0006] 需要特别指出的是，最新的研究表明，NRas突变与肺癌治疗中的TKI耐药有关。与 吉非替尼（gefitinib)敏感的PC-9细胞（PC-9/WT)相比，在产生吉非替尼耐药的PC-9细胞 (PC-9/gef)中并未检测到KRas，HER2等EGFR-TKIs耐药基因，而发现了 NRas的61位密码 子突变。并且，在吉非替尼或AZD6244/CI1040单独用药均不能促使细胞凋亡的情况下，两 者联合用药时则可以有效促进细胞凋亡 [25]。这些实验结果均表明，NRas突变在肺癌治疗 的TKI耐药中可能发挥着重要作用，这为肺癌检测与治疗提供了新的依据和可能。
[0007] 总之，越来越多的证据显示，NRas突变在人类黑色素瘤，肺癌等很多肿瘤的发生发 展中具有重要意义。对其突变的检测可准确预测对应靶向药物治疗的有效性，便于临床用 药选择，显著提高治疗效果，使患者最大程度受益；同时，还可以避免不合理用药造成的病 人医疗费用负担及社会医疗资源浪费，减少不必要的时效损失以及经济损失。
【发明内容】
[0008] 本发明针对以下检测位点设计了检测试剂盒：
[0009] 表1.突变检测位点
[0010]
【权利要求】
1. 一种NRAS基因突变检测试剂盒，其包含： (1) 内参检测试剂，其包含内参基因特异性引物、内参基因特异性探针及dNTP溶液； (2) NRAS突变检测试剂，其包含NRAS基因突变型特异性引物、NRAS基因突变型特异性 探针、内控基因特异性引物、内控基因特异性探针及dNTP溶液； (3) Taq DNA聚合酶；和 (4) NRAS阳性质控品，其包含内参基因、NRAS基因突变型及内控基因片段。
2. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述内参检测试剂中内参基因特异性引物为SEQ ID No :1 和 SEQ ID No :2。
3. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述内参检测试剂中内参基因特异性探针为SEQ ID No ：16〇
4. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述NRAS突变检测试剂中的NRAS基因突变型选自： NM1，即NRAS基因12密码子34G > A ; NM2,即NRAS基因12密码子35G > A ; NM3,即NRAS基因13密码子38G > A ; NM4,即NRAS基因61密码子181C > A ; NM5,即NRAS基因61密码子182A > T ; NM6,即NRAS基因61密码子182A > G ;和 NM7,即NRAS基因61密码子183A > T。
5. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述NRAS突变检测试剂中NRAS基因突变型特异性 引物如下： 针对NM1突变的引物为SEQ ID No :5和SEQ ID No :8 ; 针对NM2突变的引物为SEQ ID No :6和SEQ ID No :8 ; 针对NM3突变的引物为SEQ ID No :7和SEQ ID No :8 ; 针对NM4突变的引物为SEQ ID No :9和SEQ ID No :13 ; 针对NM5突变的引物为SEQ ID No :10和SEQ ID No :13 ; 针对NM6突变的引物为SEQ ID No :11和SEQ ID No :13 ; 针对NM7突变的引物为SEQ ID No :12和SEQ ID No :13。
6. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述NRAS突变检测试剂中NRAS基因突变型特异性 探针选自 SEQ ID No :14 或 SEQ ID No :15。
7. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述NRAS突变检测试剂中内控基因特异性引物为 SEQ ID No :3 和 SEQ ID No :4。
8. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述NRAS突变检测试剂中内控基因特异性探针为 SEQ ID No ：17〇
9. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述探针的5'端连接FAM基团，3'端连接BHQ1基 团。
10. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述dNTP溶液的终浓度为400 μ M。
11. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述内参基因序列为SEQ ID No :18。
12. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述内控基因序列为SEQ ID No :19。
13. 权利要求1所述的试剂盒，其中所述NRAS基因序列为SEQ ID No :20或SEQ ID No: 21。
【文档编号】C12Q1/68GK104232750SQ201410234740
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】莫敏俐, 李晖, 陈钊, 丁凤, 李隽
申请人:嘉兴雅康博医学检验所有限公司