一种制备高纯度萝卜硫素的方法
【专利摘要】一种制备高纯度萝卜硫素的方法，具体涉及从萝卜籽中提取萝卜硫素的方法。本发明以风干萝卜籽为原料，经破碎、脱脂、水解、树脂初分离、反渗透浓缩、制备分离及冷冻干燥，制备出纯度高达98％以上的产品。本发明操作简便，设备简单，反应条件温和，节约能源，生产成本低，便于推广应用。对使用后的甲醇废液进行回收处理，还对使用后的树脂进行了再生处理，产生的杂质还能再利用，因而生产安全、绿色无污染，是节能减排的生产方法。采用本发明方法制备出的萝卜硫素产品，可广泛应用于医药、保健品等行业中。
【专利说明】一种制备高纯度萝卜硫素的方法 一、
【技术领域】
[0001] 本发明属于萝卜硫素分离制备的【技术领域】，具体涉及从萝卜籽中提取萝卜硫素的 方法。 二、
【背景技术】
[0002] 硫代葡萄糖苷是十字花科蔬菜中的一种芥子苷，在硫代葡萄糖苷酶或酸的催化 下，芥子苷水解，生成萝卜硫素等异硫氰酸酯和葡萄糖。科学研究发现，萝卜硫素的化学名 为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷或1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷，是迄今为止 蔬菜中发现的最强抗癌成分之一，它可诱导机体产生II型解毒酶，该酶能防止致癌物质破 坏健康细胞内的遗传因子，所以，从十字花科蔬菜中分离纯化1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁 烷或1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷具有重要的科学价值和广阔的市场前景。
[0003] 目前，从十字花科蔬菜中提取萝卜硫素的方法有：①申请号为200910098197. 6、 名称为"一种萝卜硫素的提取方法"的发明专利，该专利公开的方法是：用干燥西兰花种 子或新鲜西兰花球为原料，粉碎加入水，调节PH4. 1?4. 5,加入粗芥子硫苷酸酶水解后冷 冻干燥成粉末；加入丙酮，浸提，过滤，将滤液真空浓缩成萝卜硫素粗品；然后将其通过硅 胶柱层析，用乙酸乙酯和乙醇的混合液梯度洗脱，收集馏分，真空浓缩；用甲醇溶解，再经 0. 2um微孔滤膜过滤后，用C18硅胶装柱，采用甲醇水梯度洗脱，收集萝卜硫素馏分，真空干 燥，得到萝卜硫素。该方法存在的主要问题是：1.未对种子进行脱脂，由于油脂的阻挡，西 兰花种子中的芥子苷和芥子硫苷酸酶难以有效接触，导致萝卜硫素的生成率低；2.未对提 取的芥子硫苷酸酶进行固定化，游离酶的半衰期短，易失活；3.使用的有机溶剂-丙酮致酶 蛋白变性能力强，导致芥子硫苷酸酶大量变性而失活。因此，该方法导致原料利用率低、萝 卜硫素生成率低，丙酮回收率低而污染环境，生产成本高，缺乏竞争力。②《食品工业科技》 2012年第33卷第4期80?82页刊登的论文"高效液相色谱法测定西兰花中萝卜硫素的 研究"，该论文公开的提取萝卜硫素的方法是：西兰花种子在无光照条件下发芽48h，冷冻干 燥成粉末，加入正己烷脱脂并挥发脱除溶剂后，在加入去离子水混合均匀，水浴处理2h，再 加入氯化钠并用等体积乙酸乙酯萃取3次，收集、合并萃取液，用旋蒸器减压蒸馏，除去乙 酸乙酯，直至残留液呈黄油状液体时止。接着用10%的乙腈溶解残留液，然后用0. 45um的 微孔滤膜过滤，最后用旋蒸器减压蒸馏，除去滤过液中的乙腈和水，获得萝卜硫素。该方法 存在的主要问题是：1.水解时未调节到硫代葡萄糖苷酶所需的最佳pH值，导致硫代葡萄糖 苷酶的活力低，萝卜硫素产率低；2.使用有机溶剂乙酸乙酯和乙腈，两种溶剂均易挥发，异 味重，有毒性，空气污染严重；因此，该方法生产的萝卜硫素成本也高，同样缺乏竞争力。 三、
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有制备萝卜硫素的方法的不足之处，提供一种制备高纯度 萝卜硫素的新方法，该方法具有充分利用资源，萝卜硫素生成率高、操作简单、溶剂可反复 回收利用、产品纯度高达98%以上，绿色无污染等特点。
[0005] 本发明的原理是：①萝卜籽油脂含量高达45%，超临界C02在适当条件下具有与 油脂类似的密度，依据相似相溶原理，可溶解萝卜籽中的油脂，因此用超临界C0 2可提取萝 卜籽中的油脂，获得脱脂萝卜籽；②萝卜籽中含有硫代葡萄糖苷及硫代葡萄糖苷酶，它们在 细胞中处于分隔状态，当细胞被破坏时，硫代葡萄糖苷酶和硫代葡萄糖苷接触，即催化硫代 葡萄糖苷水解生成萝卜硫素等异硫氰酸酯和葡萄糖；③酶被底物饱和方能发挥最大催化效 率，向脱脂萝卜籽水解体系中加入硫代葡萄糖苷，使游离硫代葡萄糖苷酶被饱和而发挥最 大催化效率，显著增加萝卜硫素的生成量；④1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷的烯 键既可加氢还原成1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷，也可氧化甚至断键，且前者的生物学活 性比后者强1?2倍，因此获得前者比后者更具价值。将脱脂萝卜籽水解体系进行真空脱 气并充入氮气，可显著降低其中的氧气，将显著降低1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁 烷的氧化；⑤1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷的2-烯基丁烷基为非极性，可与非 极性树脂形成疏水相互作用，可用非极性吸附树脂对其进行吸附，将其与极性杂质分离；⑦ 除去极性杂质的1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷经反渗透浓缩，除去甲醇后再进 入制备型液相色谱，由于该物质的结构与其它非极性杂质的差异，它们在反相C18硅胶上 的吸附力不同，因此可用适当的洗脱液进行洗脱，由于制备型液相色谱的塔板数极高，分离 效率高，因此可将其它杂质一一分离，制备出高纯度的萝卜硫素，即1-异硫氰酸-4-甲磺酰 基-(2-烯）丁烷；⑧将制备出的高纯度1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷进行反渗 透浓缩，除去其中的甲醇和部分水，即可获得浓缩液，最后将该浓缩液进行冷冻干燥，除去 水分，就制备出纯度高达98%以上的萝卜硫素，S卩1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁 烧。
[0006] 本发明的目的是这样实现的：一种制备高纯度萝卜硫素的方法，以风干萝卜籽为 原料，经破碎、脱脂、水解、树脂初分离、反渗透浓缩、制备分离及冷冻干燥，制备出纯度高达 98%以上的萝卜硫素，S卩1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷。其具体的工艺步骤如 下：
[0007] 1.制备脱脂萝卜籽粉
[0008] 取水分含量低于4%的风干萝卜籽，先用破碎机破碎，再用20?60目的不锈钢筛 网进行筛分，分别收集过筛者和未过筛者。对于未过筛的萝卜籽粉，返回破碎机进行再次破 碎；对于过筛的萝卜籽粉，置于超临界二氧化碳的萃取器的萃取釜中，在温度为30?35°C、 压力25?30MPa的条件下进行萃取lh?2h，然后将荷载萝卜籽油脂的超临界二氧化碳泵 至分离釜中，降低压力至3?5MPa，使超临界二氧化碳气化，与萝卜籽油脂分离。分别收集 气化的二氧化碳、脱二氧化碳萝卜籽油脂粗品和脱脂萝卜籽粉，对收集的气化二氧化碳，再 次冷冻至0?5°C并再次加压至25?30Mpa，可再次用于提取萝卜籽油脂；对于收集的脱二 氧化碳萝卜籽油脂粗品，用于制备精制萝卜籽油；对于收集的脱脂萝卜籽粉，分成两部分， 一部分用于制备硫代葡萄糖苷提取液，另一部分用于制备萝卜硫素粗提液。
[0009] 2.制备硫代葡萄糖苷提取液
[0010] 第1步完成后，将第1步收集的部分脱脂萝卜籽粉，分散于甲醇中，在70?75°C 的温度下进行第一次提取40?60min，脱脂萝卜籽粉质量（g)与甲醇体积（mL)之比为 1 : 6?9。第一次提取完成后进行抽滤，分别收集第一次滤过液和滤渣。对于收集的第一 次滤渣，投入到甲醇中进行第二次提取，提取条件与第一次相同。第二次提取完成后进行抽 滤，分别收集第二次滤过液和滤渣。对于收集的第二次滤渣，送入脱溶剂釜中，进行脱甲醇 处理后可用作家畜饲料添加剂；对于收集的第二次提取液，与收集的第一次提取液合并后 进行真空浓缩，直至浓缩液成膏状时止，所用浓缩真空度为0. 06?0. 09MPa、温度为40? 45°C。浓缩完成后，分别收集膏状浓缩物和甲醇，对于收集的甲醇，返回甲醇贮罐，用于再次 提取硫代葡萄糖苷；对于收集的膏状浓缩物，用蒸馏水溶解，膏状浓缩物质量（g)与蒸馏水 体积（mL)之比为1 : 3?6。溶解完成后，将溶解液置于萃取荃中，加入乙酸乙酯进行萃取 处理10?20min,溶解液与乙酸乙酯体积之比为lmL : 1?6mL。萃取完成后，分别收集萃 取相和萃余相，对收集的萃取相，进行精馏回收乙酸乙酯；对收集的萃余相，即为硫代葡萄 糖苷提取液，用于制备萝卜硫素提取液。
[0011] 3.制备萝卜硫素粗提液
[0012] 第2步完成后，先将第1步收集的另一部分脱脂萝卜籽粉分散于pH5. 0?6. 0的 柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液中，搅拌均匀，脱脂萝卜籽粉质量（g)与PH5. 0?6. 0的柠檬 酸-柠檬酸三钠缓冲溶液体积（mL)之比为1 : 6?12,再加入第2步收集的硫代葡萄糖苷 提取液，加入的硫代葡萄糖苷提取液体积（mL)与脱脂萝卜籽粉质量（g)之比为1 : 10? 20,混合均匀后就获得制备萝卜硫素粗提液酶水解体系。然后在25?35°C、40?120r/min 的搅拌速度下避光水解5?10h。水解完成后，进行过滤，分别收集滤过液和滤渣。对收集的 滤渣，分散于温度为25?35°C的蒸馏水中，蒸馏水体积（mL)与滤渣质量（g)之比为10? 20 : 1，在40?120r/min的搅拌速度下避光洗涤20?30min，接着进行过滤，分别收集洗 涤滤过液和滤渣。对收集的洗涤滤渣，干燥后用做家畜饲料添加剂；对收集的洗涤液，与收 集的水解滤过液合并，用稀盐酸调节pH至2?4后离心，离心机转速为10000?16000r/ min。分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，干燥后做饲料添加剂；对收集的离 心清液，泵入脱气罐中，在真空度为〇. 06?0. 09MPa、温度为10?35°C的条件下，保持20? 40min，脱去液体中的氧气。然后充入0. 1?0. 3MPa的高纯度氮气，保持20?40min，即制 备出萝卜硫素粗提液，用于制备初步纯化萝卜硫素浓缩液。
[0013] 4.制备脱氧充氮甲醇-水洗脱液
[0014] 分别配制甲醇体积浓度为5?15%、60?80%的甲醇-水溶液，再分别移入脱气 罐中，在真空度为0. 06?0. 09MPa、温度为10?35°C的条件下，保持20?40min，脱去其 中的氧气。然后充入〇. 1?〇. 3MPa的高纯度氮气，保持20?40min，即制备出脱氧充氮甲 醇-水洗脱液，用于制备萝卜硫素初步纯化浓缩液。
[0015] 5.制备萝卜硫素初步纯化浓缩液
[0016] 第3步完成之后，将第3步制备出的萝卜硫素粗提液泵入活化SP850或聚酰胺吸 附树脂柱，吸附其中的萝卜硫素，萝卜硫素粗提液体积（mL)与SP850或聚酰胺吸附树脂的 体积（mL)比为1 : 15?30,以流速为5?10BV/h通过SP850或聚酰胺吸附树脂柱。吸附 完成后收集荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱和脱附萝卜硫素的过柱溶液，对于 收集的脱附萝卜硫素的过柱溶液，进行生化处理，达标后排放；对于收集的荷载萝卜硫素的 SP850或聚酰胺吸附树脂柱，先用2BV、甲醇体积浓度为5?15%的脱氧充氮甲醇-水洗脱 液、以3?6BV/h的流速洗涤夹杂于树脂间的杂质，分别收集甲醇洗涤液和洗去树脂间杂质 的荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，对收集的甲醇洗涤液，减压蒸馏回收甲醇 后进行生化处理，达标后排放；回收的甲醇可用于再次配制甲醇积浓度为5?15%或60? 80%的脱氧充氮甲醇-水洗脱液。对收集的洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850或聚 酰胺吸附树脂柱，泵入甲醇积浓度为60?80%的脱氧充氮甲醇-水洗脱液以3?6BV/h的 流速洗脱被吸附的萝卜硫素，直至甲醇体积浓度为60?80%的脱氧充氮甲醇-水洗脱液的 耗量达到SP850或聚酰胺吸附树脂柱体积（mL)的5?10BV时止。分别收集荷载萝卜硫素的 洗脱液和脱附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，对于收集的脱附萝卜硫素的SP850 或聚酰胺吸附树脂柱，进行再生处理；对于收集的荷载萝卜硫素的甲醇洗脱液，泵入反渗透 器中，在压力低于0. 4MPa下进行反渗透浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到20? 30%时为止。分别收集反渗透截留液和滤过液，对于收集的反渗透截留液，泵入真空浓缩机 中，在真空度为0. 06?0. 09MPa、温度为30?45°C的条件下，进行真空浓缩，直至浓缩液无 甲醇味时为止，就制备出萝卜硫素初步纯化浓缩液，用于制备高纯度萝卜硫素冻干物。对于 收集的反渗透滤过液，进行减压蒸馏回收甲醇后进行生化处理，达标后排放；对于回收的甲 醇，可用于再次配制甲醇体积浓度为5?15%或60?80%的脱氧充氮甲醇-水洗脱液。
[0017] 6.制备高纯度萝卜硫素冻干物
[0018] 第5步完成后，先将第5步制备的萝卜硫素初步纯化浓缩液通过0. 22um微孔过滤 膜过滤，再泵入以反相C18硅胶为填料的制备型液相色谱柱中，萝卜硫素初步纯化浓缩液 体积（mL)与C18硅胶填料质量（g)之比为1 : 50?80。接着控制色谱条件进行制备分 离萝卜硫素，具体的色谱条件为：检测波长为245nm，柱温为25°C，流速为1. OmL · min-1 ;A 组分为甲醇，B组分为超纯水；梯度洗脱程序为：在Omin?15min区间，流动相中的A组分 由5%上升至25%，B组分由95%下降至75%;在15min?75min区间，流动相中的A组分 由25%上升至65%，B组分由75%下降至35%。收集37?41min区间的洗脱液，在35? 45°C下进行真空浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到30?50%时，就制备出萝卜硫 素浓缩液。将该萝卜硫素浓缩液置于冻干机中，在25?45Pa真空度、-50?-60°C温度下， 进行冷冻干燥24?36h，就制备出纯度为98%以上的萝卜硫素。经核磁共振、液质联机和 旋光仪分析鉴定，所制备出的萝卜硫素的化学结构为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯） 丁烷。
[0019] 7.制备再生树脂柱
[0020] 向第5步收集的脱附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱泵入3?4BV的无水 甲醇，以2?5BV/h的流速洗脱树脂吸附的杂质，分别收集洗脱液和脱附杂质的SP850或聚 酰胺吸附树脂柱。对收集的甲醇洗脱液，含有异硫氰酸酯类物质，减压蒸馏回收甲醇后分别 收集甲醇和浓缩液，对于收集的甲醇，进行脱水处理，制备出无水甲醇，可再次用于洗脱脱 附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，制备再生树脂；对于收集的浓缩液，用于配制异 硫氰酸酯类生物农药。对于收集的洗脱杂质的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，用1?2BV的 蒸馏水以2?5BV/h的流速洗涤，分别收集经该蒸馏水洗涤的SP850或聚酰胺吸附树脂柱 和洗涤液，对收集的蒸馏水洗涤的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，即为再生树脂柱，可再次用 于纯化萝卜硫素粗提液；对于收集的洗涤液，可用于配制脱氧充氮甲醇-水洗脱液。
[0021] 本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：
[0022] 1.本发明方法在生产过程中使用破碎、脱脂、水解、树脂初分离、反渗透浓缩、制备 分离及冷冻干燥等简单工艺，操作简便，设备简单，反应条件温和，节约能源，生产成本低， 便于推广应用。
[0023] 2.本发明方法在生产过程中，先对萝卜籽粉进行超临界二氧化碳脱脂后再水解， 硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷酶可以得到充分而有效的接触，从而产物的生成率大大提 高，而且在水解时加入了底物硫代葡萄糖苷，采用脱氧充氮甲醇-水作洗脱液，进一步提高 了产物的生成率。
[0024] 3.本发明方法在生产过程中，通过树脂进行初分离、反渗透浓缩、液相制备及真空 浓缩的纯化步骤，其中由于制备型液相色谱的塔板数极高，每米的塔板数在20000以上，分 离效率高，因此制备出的产物纯度极高，达98%以上。
[0025] 4.本发明在生产过程中，使用超临界二氧化碳对萝卜籽粉末脱脂，对使用后的甲 醇废液进行回收处理，还对使用后的树脂进行了再生处理，这使得生产过程安全、绿色无污 染。
[0026] 本发明方法是节能减排、安全生产且成本低，便于推广应用的理想的方法。采用本 发明方法制备出的萝卜硫素，即1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷产品，可广泛应用 于医药、保健品行业中，有防癌抗癌等功能。 四、【具体实施方式】
[0027] 下面结合【具体实施方式】，进一步说明本发明。
[0028] 实施例1
[0029] -种制备高纯度萝卜硫素的方法，具体方法步骤如下：
[0030] 1.制备脱脂萝卜籽粉
[0031] 取水分含量低于4%的风干萝卜籽，先用破碎机破碎，再用20目的不锈钢筛网 进行筛分，分别收集过筛者和未过筛者。对于未过筛的萝卜籽粉，返回破碎机进行再次破 碎；对于过筛的萝卜籽粉，置于超临界二氧化碳的萃取器的萃取釜中，在温度为30°C、压力 25MPa的条件下进行萃取lh，然后将荷载萝卜籽油脂的超临界二氧化碳泵至分离釜中，降 低压力至3MPa，使超临界二氧化碳气化，与萝卜籽油脂分离。分别收集气化的二氧化碳、脱 二氧化碳萝卜籽油脂粗品和脱脂萝卜籽粉，对收集的气化二氧化碳，再次冷冻至〇°C并再次 加压至25Mpa，可再次用于提取萝卜籽油脂；对于收集的脱二氧化碳萝卜籽油脂粗品，用于 制备精制萝卜籽油；对于收集的脱脂萝卜籽粉，分成两部分，一部分用于制备硫代葡萄糖苷 提取液，另一部分用于制备萝卜硫素粗提液。
[0032] 2.制备硫代葡萄糖苷提取液
[0033] 第1步完成后，将第1步收集的部分脱脂萝卜籽粉，分散于甲醇中，在70°C的温度 下进行第一次提取40min，脱脂萝卜籽粉质量（g)与甲醇体积（mL)之比为1 : 6。第一次 提取完成后进行抽滤，分别收集第一次滤过液和滤渣。对于收集的第一次滤渣，投入到甲醇 中进行第二次提取，提取条件与第一次相同。第二次提取完成后进行抽滤，分别收集第二次 滤过液和滤渣。对于收集的第二次滤渣，送入脱溶剂釜中，进行脱甲醇处理后可用作家畜饲 料添加剂；对于收集的第二次提取液，与收集的第一次提取液合并后进行真空浓缩，直至浓 缩液成膏状时止，所用浓缩真空度为〇. 〇6MPa、温度为40°C。浓缩完成后，分别收集膏状浓 缩物和甲醇，对于收集的甲醇，返回甲醇贮罐，用于再次提取硫代葡萄糖苷；对于收集的膏 状浓缩物，用蒸馏水溶解，膏状浓缩物质量（g)与蒸馏水体积（mL)之比为1 : 3。溶解完成 后，将溶解液置于萃取釜中，加入乙酸乙酯进行萃取处理l〇min，溶解液与乙酸乙酯体积之 比为lmL : lmL。萃取完成后，分别收集萃取相和萃余相，对收集的萃取相，进行精馏回收乙 酸乙酯；对收集的萃余相，即为硫代葡萄糖苷提取液，用于制备萝卜硫素提取液。
[0034] 3.制备萝卜硫素粗提液
[0035] 第2步完成后，先将第1步收集的另一部分脱脂萝卜籽粉分散于pH5. 0的柠檬 酸-柠檬酸三钠缓冲溶液中，搅拌均匀，脱脂萝卜籽粉质量（g)与PH5.0?6.0的柠檬 酸-柠檬酸三钠缓冲溶液体积（mL)之比为1 : 6,再加入第2步收集的硫代葡萄糖苷提取 液，加入的硫代葡萄糖苷提取液体积（mL)与脱脂萝卜籽粉质量（g)之比为1 : 10,混合均 匀后就获得制备萝卜硫素粗提液酶水解体系。然后在25°C、40r/min的搅拌速度下避光水 解l〇h。水解完成后，进行过滤，分别收集滤过液和滤渣。对收集的滤渣，分散于温度为25°C 的蒸馏水中，蒸馏水体积（mL)与滤渣质量（g)之比为10 : 1，在40r/min的搅拌速度下避 光洗涤30min，接着进行过滤，分别收集洗涤滤过液和滤渣。对收集的洗涤滤渣，干燥后用 做家畜饲料添加剂；对收集的洗涤液，与收集的水解滤过液合并，用稀盐酸调节pH至2后离 心，离心机转速为l〇〇〇〇r/min。分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，干燥后 做饲料添加剂；对收集的离心清液，泵入脱气罐中，在真空度为〇. 〇6MPa、温度为10°C的条 件下，保持20min，脱去液体中的氧气。然后充入0. 12MPa的高纯度氮气，保持20min，即制 备出萝卜硫素粗提液，用于制备初步纯化萝卜硫素浓缩液。
[0036] 4制备脱氧充氮甲醇-水洗脱液
[0037] 分别配制甲醇体积浓度为5 %、60 %的甲醇-水溶液，再分别移入脱气罐中，在真 空度为〇. 〇6MPa、温度为10°C的条件下，保持20min，脱去其中的氧气。然后充入0. 12MPa的 高纯度氮气，保持20min，即制备出脱氧充氮甲醇-水洗脱液，用于制备萝卜硫素初步纯化 浓缩液。
[0038] 5.制备萝卜硫素初步纯化浓缩液
[0039] 第3步完成之后，将第3步制备出的萝卜硫素粗提液泵入活化SP850吸附树脂 柱，吸附其中的萝卜硫素，萝卜硫素粗提液体积（mL)与SP850吸附树脂的体积（mL)比为 1 : 15,以流速为5BV/h通过SP850吸附树脂柱。吸附完成后收集荷载萝卜硫素的SP850 吸附树脂柱和脱附萝卜硫素的过柱溶液，对于收集的脱附萝卜硫素的过柱溶液，进行生化 处理，达标后排放；对于收集的荷载萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，先用2BV、甲醇体积浓 度为5%的脱氧充氮甲醇-水洗脱液、以3BV/h的流速洗涤夹杂于树脂间的杂质，分别收 集甲醇洗涤液和洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，对收集的甲醇洗涤 液，减压蒸馏回收甲醇后进行生化处理，达标后排放；回收的甲醇可用于再次配制甲醇积浓 度为5%或60%的脱氧充氮甲醇-水洗脱液。对收集的洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素 的SP850吸附树脂柱，泵入甲醇积浓度为60%的脱氧充氮甲醇-水洗脱液以3BV/h的流速 洗脱被吸附的萝卜硫素，直至甲醇体积浓度为60%的脱氧充氮甲醇-水洗脱液的耗量达到 SP850吸附树脂柱体积（mL)的5BV时止。分别收集荷载萝卜硫素的洗脱液和脱附萝卜硫 素的SP850吸附树脂柱，对于收集的脱附萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，进行再生处理；对 于收集的荷载萝卜硫素的甲醇洗脱液，泵入反渗透器中，在压力低于〇. 4MPa下进行反渗透 浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到20%时为止。分别收集反渗透截留液和滤过 液，对于收集的反渗透截留液，泵入真空浓缩机中，在真空度为〇. 〇6MPa、温度为30°C的条 件下，进行真空浓缩，直至浓缩液无甲醇味时为止，就制备出萝卜硫素初步纯化浓缩液，用 于制备高纯度萝卜硫素冻干物。对于收集的反渗透滤过液，进行减压蒸馏回收甲醇后进行 生化处理，达标后排放；对于回收的甲醇，可用于再次配制甲醇体积浓度为5%或60%的脱 氧充氮甲醇-水洗脱液。
[0040] 6.制备高纯度萝卜硫素冻干物
[0041] 第5步完成后，先将第5步制备的萝卜硫素初步纯化浓缩液通过0. 22um微孔过滤 膜过滤，再泵入以反相C18硅胶为填料的制备型液相色谱柱中，萝卜硫素初步纯化浓缩液 体积（mL)与C18硅胶填料质量（g)之比为1 : 50。接着控制色谱条件进行制备分离萝卜 硫素，具体的色谱条件为：检测波长为245nm，柱温为25°C，流速为1. OmL · min-1 ;A组分为 甲醇，B组分为超纯水；梯度洗脱程序为：在Omin?15min区间，流动相中的A组分由5%上 升至25%，8组分由95%下降至75%;在1511^11?751^11区间，流动相中的六组分由25% 上升至65%，B组分由75%下降至35%。收集37?41min区间的洗脱液，在35°C下进行 真空浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到30%时，就制备出萝卜硫素浓缩液。将该萝 卜硫素浓缩液置于冻干机中，在25Pa真空度、-60°C温度下，进行冷冻干燥24h，就制备出纯 度为98%以上的萝卜硫素。经核磁共振、液质联机和旋光仪分析鉴定，所制备出的萝卜硫素 的化学结构为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷。
[0042] 7.制备再生树脂柱
[0043] 向第5步收集的脱附萝卜硫素的SP850吸附树脂柱泵入3BV的无水甲醇，以2BV/ h的流速洗脱树脂吸附的杂质，分别收集洗脱液和脱附杂质的SP850吸附树脂柱。对收集的 甲醇洗脱液，含有异硫氰酸酯类物质，减压蒸馏回收甲醇后分别收集甲醇和浓缩液，对于收 集的甲醇，进行脱水处理，制备出无水甲醇，可再次用于洗脱脱附萝卜硫素的SP850吸附树 脂柱，制备再生树脂；对于收集的浓缩液，用于配制异硫氰酸酯类生物农药。对于收集的洗 脱杂质的SP850吸附树脂柱，用1BV的蒸馏水以2BV/h的流速洗涤，分别收集经该蒸馏水洗 涤的SP850吸附树脂柱和洗涤液，对收集的蒸馏水洗涤的SP850吸附树脂柱，即为再生树脂 柱，可再次用于纯化萝卜硫素粗提液；对于收集的洗涤液，可用于配制脱氧充氮甲醇-水洗 脱液。
[0044] 实施例2
[0045] -种制备高纯度萝卜硫素的方法，具体方法步骤如下：
[0046] 1.制备脱脂萝卜籽粉
[0047] 同实施例1，其中：用40目的不锈钢筛网进行筛分破碎后的萝卜籽。在温度为 33°C、压力28MPa的条件下进行萃取1. 5h。降低压力至4MPa，使超临界二氧化碳气化，与萝 卜籽油脂分离。对收集的气化二氧化碳，再次冷冻至3°C并再次加压至28Mpa。
[0048] 2.制备硫代葡萄糖苷提取液
[0049] 同实施例1，其中：在73°C的温度下进行第一次提取50min，脱脂萝卜籽粉质量（g) 与甲醇体积（mL)之比为1 : 7。浓缩真空度为0. 08MPa、温度为43°C。膏状浓缩物质量（g) 与蒸馏水体积（mL)之比为1 : 5。乙酸乙酯进行萃取处理15min，溶解液与乙酸乙酯体积 之比为lmL : 5mL。
[0050] 3.制备萝卜硫素粗提液
[0051] 同实施例1，其中：脱脂萝卜籽粉分散于PH5.5的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液 中，脱脂萝卜籽粉质量（g)与PH5. 5的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液体积（mL)之比为 1 : 9。硫代葡萄糖苷提取液体积（mL)与脱脂萝卜籽粉质量（g)之比为1 : 15。在30°C、 80r/min的搅拌速度下避光水解7h。对收集的滤渣，分散于温度为30°C的蒸馏水中，蒸馏水 体积（mL)与滤渔质量（g)之比为15 : 1，在80r/min的搅拌速度下避光洗漆25min。对收集 的洗涤液，与收集的水解滤过液合并，用稀盐酸调节pH至3后离心，离心机转速为13000r/ min。对收集的离心清液，泵入脱气罐中，在真空度为0. 07MPa、温度为25°C的条件下，保持 30min。然后充入0. 2MPa的高纯度氮气，保持30min。
[0052] 4.制备脱氧充氮甲醇-水洗脱液
[0053] 同实施例1，其中：分别配制甲醇体积浓度为的甲醇-水溶液，再分别移 入脱气罐中，在真空度为〇. 〇8MPa、温度为25°C的条件下，保持30min。然后充入0. 2MPa的 高纯度氮气，保持30min。
[0054] 5.制备萝卜硫素初步纯化浓缩液
[0055] 同实施例1，其中：将第3步制备出的萝卜硫素粗提液泵入活化聚酰胺吸附树脂 柱，萝卜硫素粗提液体积（mL)与聚酰胺吸附树脂的体积（mL)比为1 : 20,以流速为7BV/h 通过聚酰胺吸附树脂柱。对于收集的荷载萝卜硫素的聚酰胺吸附树脂柱，先用2BV、甲醇体 积浓度为10%的脱氧充氮甲醇-水洗脱液、以4BV/h的流速洗涤夹杂于树脂间的杂质，对收 集的洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的聚酰胺吸附树脂柱，泵入甲醇积浓度为70%的脱氧 充氮甲醇-水洗脱液以4BV/h的流速洗脱被吸附的萝卜硫素，直至甲醇体积浓度为70%的 脱氧充氮甲醇-水洗脱液的耗量达到聚酰胺吸附树脂柱体积（mL)的7BV时止。对于收集 的荷载萝卜硫素的甲醇洗脱液，反渗透浓缩至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到25%时为 止。反渗透截留液，泵入真空浓缩机中，在真空度为〇. 〇7MPa、温度为40°C的条件下，进行真 空浓缩。
[0056] 6.制备高纯度萝卜硫素冻干物
[0057] 同实施例1，其中：萝卜硫素初步纯化浓缩液体积（mL)与C18硅胶填料质量（g)之 比为1 : 65。对收集37?41min区间的洗脱液，在40°C下进行真空浓缩，直至浓缩液中萝 卜硫素质量浓度达到50%时。将该萝卜硫素浓缩液置于冻干机中，在真空度35Pa、-55°C温 度下，进行冷冻干燥30h。
[0058] 7.制备再生树脂柱
[0059] 同实施例1，向第5步收集的脱附萝卜硫素的聚酰胺吸附树脂柱泵入3. 5BV的无水 甲醇，以3BV/h的流速洗脱树脂吸附的杂质，对于收集的洗脱杂质的聚酰胺吸附树脂柱，用 1. 5BV的蒸馏水以3BV/h的流速洗涤。
[0060] 实施例3
[0061] 一种制备高纯度萝卜硫素的方法，具体方法步骤如下：
[0062] 1.制备脱脂萝卜籽粉
[0063] 同实施例1，其中：用60目的不锈钢筛网进行筛分破碎后的萝卜籽。在温度为 35°C、压力30MPa的条件下进行萃取2h。降低压力至5MPa，使超临界二氧化碳气化，与萝卜 籽油脂分离。对收集的气化二氧化碳，再次冷冻至5°C并再次加压至30Mpa。
[0064] 2.制备硫代葡萄糖苷提取液
[〇〇65] 同实施例1，其中：在75°C的温度下进行第一次提取60min，脱脂萝卜籽粉质量（g) 与甲醇体积（mL)之比为1 : 9。浓缩真空度为0.09MPa、温度为45°C。膏状浓缩物质量（g)
【权利要求】
1. 一种制备高纯度萝卜硫素的方法，其特征在于具体方法步骤如下： (1) .制备脱脂萝卜籽粉 取水分含量低于4%的风干萝卜籽，先用破碎机破碎，再用20?60目的不锈钢筛网进 行筛分，分别收集过筛者和未过筛者，对于未过筛的萝卜籽粉，返回破碎机进行再次破碎， 对于过筛的萝卜籽粉，置于超临界二氧化碳的萃取器的萃取釜中，在温度为30?35°C、压 力25?30MPa的条件下进行萃取lh?2h，然后将荷载萝卜籽油脂的超临界二氧化碳泵至 分离釜中，降低压力至3?5MPa，使超临界二氧化碳气化，与萝卜籽油脂分离，分别收集气 化的二氧化碳、脱二氧化碳萝卜籽油脂粗品和脱脂萝卜籽粉，对收集的气化二氧化碳，再次 冷冻至0?5°C并再次加压至25?30Mpa ; (2) .制备硫代葡萄糖苷提取液 第（1)步完成后，将第（1)步收集的部分脱脂萝卜籽粉，分散于甲醇中，在70?75°C的 温度下进行第一次提取40?60min，脱脂萝卜籽粉质量与甲醇体积之比为lg : 6?9mL， 第一次提取完成后进行抽滤，分别收集第一次滤过液和滤渣，对于收集的第一次滤渣，投入 到甲醇中进行第二次提取，提取条件与第一次相同，第二次提取完成后进行抽滤，分别收集 第二次滤过液和滤渣，对于收集的第二次滤渣，送入脱溶剂釜中，进行脱甲醇处理，对于收 集的第二次提取液，与收集的第一次提取液合并后进行真空浓缩，直至浓缩液成膏状时止， 所用浓缩真空度为〇. 06?0. 09MPa、温度为40?45°C，浓缩完成后，分别收集膏状浓缩物 和甲醇，对于收集的甲醇，返回甲醇贮罐，用于再次提取硫代葡萄糖苷，对于收集的膏状浓 缩物，用蒸馏水溶解，膏状浓缩物质量与蒸馏水体积之比为lg : 3?6mL，溶解完成后，将溶 解液置于萃取釜中，加入乙酸乙酯进行萃取处理10?20min，溶解液与乙酸乙酯体积之比 为lmL : 1?6mL，萃取完成后，分别收集萃取相和萃余相，对收集的萃取相，进行精馏回收 乙酸乙酯； (3) .制备萝卜硫素粗提液 第（2)步完成后，先将第（1)步收集的另一部分脱脂萝卜籽粉分散于pH5.0?6.0的柠 檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液中，搅拌均匀，脱脂萝卜籽粉质量与PH5. 0?6. 0的柠檬酸-柠 檬酸三钠缓冲溶液体积之比为lg : 6?12mL，再加入第2步收集的硫代葡萄糖苷提取液， 加入的硫代葡萄糖苷提取液体积与脱脂萝卜籽粉质量之比为lmL : 10?20g，混合均匀 后就获得制备萝卜硫素粗提液酶水解体系，然后在25?35°C、40?120r/min的搅拌速度 下避光水解5?10h，水解完成后，进行过滤，分别收集滤过液和滤渣，对收集的滤渣，分散 于温度为25?35°C的蒸馏水中，蒸馏水体积与滤渣质量之比为10?20mL : lg，在40? 120r/min的搅拌速度下避光洗漆20?30min，接着进行过滤，分别收集洗漆滤过液和滤渔， 对收集的洗涤液，与收集的水解滤过液合并，用稀盐酸调节pH至2?4后离心，离心机转 速为10000?16000r/min，分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心清液，泵入脱气罐 中，在真空度为0. 06?0. 09MPa、温度为10?35°C的条件下，保持20?40min，脱去液体中 的氧气，然后充入〇. 1?〇. 3MPa的高纯度氮气，保持20?40min，即制备出萝卜硫素粗提 液； (4) .制备脱氧充氮甲醇-水洗脱液 分别配制甲醇体积浓度为5?15%、60?80%的甲醇-水溶液，再分别移入脱气罐中， 在真空度为〇. 06?0. 09MPa、温度为10?35°C的条件下，保持20?40min，脱去其中的氧 气，然后充入0. 1?0. 3MPa的高纯度氮气，保持20?40min，即制备出脱氧充氮甲醇-水洗 脱液； (5) .制备萝卜硫素初步纯化浓缩液 第（3)步完成之后，将第（3)步制备出的萝卜硫素粗提液泵入活化SP850或聚酰胺吸 附树脂柱，吸附其中的萝卜硫素，萝卜硫素粗提液体积与SP850或聚酰胺吸附树脂的体积 比为lmL : 15?30mL，以流速为5?10BV/h通过SP850或聚酰胺吸附树脂柱，吸附完成后 收集荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱和脱附萝卜硫素的过柱溶液，对于收集的 脱附萝卜硫素的过柱溶液，进行生化处理，达标后排放，对于收集的荷载萝卜硫素的SP850 或聚酰胺吸附树脂柱，先用2BV、甲醇体积浓度为5?15 %的脱氧充氮甲醇-水洗脱液、以 3?6BV/h的流速洗涤夹杂于树脂间的杂质，分别收集甲醇洗涤液和洗去树脂间杂质的荷 载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，对收集的甲醇洗涤液，减压蒸馏回收甲醇后进 行生化处理，达标后排放，对收集的洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸 附树脂柱，泵入甲醇积浓度为60?80%的脱氧充氮甲醇-水洗脱液以3?6BV/h的流速洗 脱被吸附的萝卜硫素，直至甲醇体积浓度为60?80%的脱氧充氮甲醇-水洗脱液的耗量达 到SP850或聚酰胺吸附树脂柱体积的5?10BV时止，分别收集荷载萝卜硫素的洗脱液和脱 附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，对于收集的脱附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸 附树脂柱，进行再生处理，对于收集的荷载萝卜硫素的甲醇洗脱液，泵入反渗透器中，在压 力低于0. 4MPa下进行反渗透浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到20?30%时为 止，分别收集反渗透截留液和滤过液，对于收集的反渗透截留液，泵入真空浓缩机中，在真 空度为〇. 06?0. 09MPa、温度为30?45°C的条件下，进行真空浓缩，直至浓缩液无甲醇味 时为止，就制备出萝卜硫素初步纯化浓缩液，对于收集的反渗透滤过液，进行减压蒸馏回收 甲醇后进行生化处理，达标后排放； (6) .制备高纯度萝卜硫素冻干物 第（5)步完成后，先将第（5)步制备的萝卜硫素初步纯化浓缩液通过0. 22um微孔过滤 膜过滤，再泵入以反相C18硅胶为填料的制备型液相色谱柱中，萝卜硫素初步纯化浓缩液 体积与C18硅胶填料质量之比为lmL : 50?80g，接着控制色谱条件进行制备分离萝卜硫 素，具体的色谱条件为：检测波长为245nm，柱温为25°C，流速为1. OmL · min-1 ;A组分为甲 醇，B组分为超纯水，梯度洗脱程序为：在Omin?15min区间，流动相中的A组分由5%上 升至25%，B组分由95%下降至75%，在15min?75min区间，流动相中的A组分由25% 上升至65%，B组分由75%下降至35%，收集37?4lmin区间的洗脱液，在35?45°C下 进行真空浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到30?50%时，就制备出萝卜硫素浓缩 液，将该萝卜硫素浓缩液置于冻干机中，在25?45Pa真空度、-50?-60°C温度下，进行冷 冻干燥24?36h，就制备出纯度为98%以上的萝卜硫素，经核磁共振、液质联机和旋光仪分 析鉴定，所制备出的萝卜硫素的化学结构为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯）丁烷； (7) 制备再生树脂柱 向第（5)步收集的脱附了萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱泵入3?4BV的无水 甲醇，以2?5BV/h的流速洗脱树脂吸附的杂质，分别收集洗脱液和脱附杂质的SP850或聚 酰胺吸附树脂柱，对收集的甲醇洗脱液，减压蒸馏回收甲醇后分别收集甲醇和浓缩液，对于 收集的甲醇进行脱水处理，制备出无水甲醇，对于收集的洗脱杂质的SP850或聚酰胺吸附 树脂柱，用1?2BV的蒸馏水以2?5BV/h的流速洗涤，分别收集经该蒸馏水洗涤的SP850 或聚酰胺吸附树脂柱和洗涤液，对收集的蒸馏水洗涤后的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，即 为再生树脂柱，可再次用于纯化萝卜硫素粗提液，对于收集的洗涤液，可用于配制脱氧充氮 甲醇-水洗脱液。
【文档编号】C12P13/00GK104059947SQ201410253792
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】刘庆海, 万玉萍, 颜李秀, 冯琳, 周小华 申请人:重庆海巨农业发展有限公司, 重庆大学