一种体外分离记忆性b细胞方法的建立的制作方法
【专利摘要】一种体外分离记忆性B细胞方法的建立，是利用血浆中总的淋巴细胞和记忆性B细胞本身特性最终实现记忆性B细胞的分离和纯化：首先根据血浆中淋巴细胞和红细胞密度的不同利用淋巴细胞分离液分离出总淋巴细胞，即外周血单核细胞；之后根据外周血单核细胞中记忆性B细胞特有的识别蛋白CD19和CD27利用免疫磁珠分选方法分离纯化得到较纯的记忆性B细胞。本发明的优点是：相较于其他体外分离记忆性B淋巴细胞的方法，本发明利用免疫磁珠负分选法分选出的记忆性B淋巴细胞不影响B淋巴细胞的正常生长和功能、特异性好、纯度高、收获率高。
【专利说明】一种体外分离记忆性B细胞方法的建立
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种体外分离记忆性B细胞方法的建立。
【背景技术】
[0002] 在血液中B细胞约占淋巴细胞总数的15%。固定在B细胞膜表面的免疫球蛋白（主 要是单体IgM和IgD)是抗原的特异性受体。当它们初次与某一个抗原接触而被致敏时，一 部分B细胞即分化成熟为浆细胞，浆细胞即开始生成对该抗原特异的免疫球蛋白并将它们 释放到周围的组织液中，这就是免疫抗体。有小部分受抗原刺激的B细胞发展成为记忆性B 细胞，寿命很长，且保持特异性，由它们增殖生成的后代细胞也保持着这种特异性。当它们 再次接触具有同样特异性的抗原时，便能迅速被激活，成为特异B淋巴母细胞。由记忆性B 细胞增殖生成的后代细胞愈多，被特异性抗原、激活的B细胞数也愈多。可见B细胞系统的 "记忆"能力是取决于具有抗原特异性的记忆细胞数目的多少。
[0003] 当机体受到某一特异性抗原刺激后，产生的特异性抗体会随着时间的增长而衰 减，而记忆性B细胞可以永久存在，记录着过去的免疫反应。近来，越来越多的研究者利用 记忆性B细胞的这种特性筛选新的治疗用抗体。
[0004] 然而，目前大多数用于分离记忆性B淋巴细胞的方法的缺点明显：影响B细胞功 能、纯度不好、非特异结合、收获率较低。本发明中，我们利用淋巴细胞分离液分离出外周血 单核细胞，再用免疫磁珠负分选法分选出记忆性B淋巴细胞，可用于记忆性B细胞的功能研 究和相应疾病的抗体制备。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种体外分离记忆性B淋巴细胞的方 法。
[0006] 本发明是利用淋巴细胞分离液分离出外周血单核细胞，再用免疫磁珠分选法分选 出记忆性B淋巴细胞。
[0007] 本发明所述制备方法包括下列步骤： 1、 呼吸道合胞病毒感染者血液阳性病人筛选及其血液采集：鉴于100%的人群儿时都 感染过呼吸道合胞病毒，随机挑选志愿者，每人抽取3 mL新鲜血液，设定离心机转速为2000 转离心5 min，此时所有细胞聚集于管底，吸取上清至新的EP管中，编号并利用呼吸道合胞 病毒检测试剂盒Human RSV Elisa Kit筛选体内呼吸道合胞病毒阳性高的志愿者； 2、 外周血单核细胞的分离：从阳性呼吸道合胞病毒病人体内抽取20mL新鲜血液并用 肝素钠作为抗凝剂，之后加入等体积的缓冲体系Hanks液与抗凝全血样本混合后加入到等 体积的淋巴细胞分离液中，设置离心机转速为2000rpm离心20min，取出离心管，管内溶液 中的云雾状层即为外周血单核细胞；将云雾状溶液转移至新的15mL离心管中，利用Hanks 液洗涤2次，用含体积比为10%FBS的PBS洗涤1次，1500rpm离心20min，利用体积比为 10%FBS的PBS重悬，并进行细胞计数； 3、 总B淋巴细胞分选：将筛选得到的外周血单核细胞重悬，离心机转速为300rpm离心 lOmin，弃上清；用含体积比10%FBS的PBS稀释悬浊液为107个细胞/40uL，之后将每107个 细胞加入到10uL Biotin-Antibody Cocktail中，混勻后4°C放置lOmin ;再以每107个细胞 加入30uL的含体积比为10%FBS的PBS及20uL Anti-Biotin MicroBeads中，混匀后于4°C 冰箱四维旋转混匀器上转动30min ;按每107个细胞加入l-2mL的含体积比为10%FBS的PBS 洗涤细胞，离心机转速300rpm离心lOmin，弃上清后加入500uL含体积比为10%FBS的PBS 重悬细胞；将分选柱子放置到磁铁上，用适量的含体积比为10%FBS的PBS冲洗柱子；将细 胞悬液加到柱子中，收集流出液，用5ml体积比为10%FBS的PBS洗柱3次，洗柱过程中要等 柱子中液体流干后再加含体积比为10%FBS的PBS，收集所有洗脱液，即为B细胞悬液； 4、 记忆性B淋巴细胞的分选：将B细胞悬液在离心机中按300rpm离心lOmin后弃上 清，每1〇7个细胞加入80uL含体积比为10%FBS的PBS重悬细胞；以每10 7个细胞加入20uL CD19和CD27 MicroBeads混匀，4°C冰箱中四维旋转混匀器上转动15min ;再以每107个细胞 加入l-2mL含体积比为10%FBS的PBS洗涤细胞，在离心机上300rpm离心lOmin，弃上清后 加入500uL含体积比为10%FBS的PBS重悬细胞，如果细胞较多，缓冲液加倍；将分选柱子放 置到磁铁上，用含体积比为10%FBS的PBS冲洗柱子；将细胞悬液加到柱子中，收集流出液， 用含体积比为l〇%FBS的PBS冲柱三次，冲柱过程中要等柱子中液体流干后再加含体积比为 10%FBS的PBS，收集所有洗脱液，即为含未标记细胞的悬液；从分离器上取下柱子放到一个 收集管上，吸取适量含体积比为10%FBS的PBS至柱子中，立即用力推动活塞洗出磁珠标记 的细胞，即为含记忆性B细胞的悬液，细胞计数。
[0008] 本发明的有益效果：相较于其他体外分离记忆性B淋巴细胞的方法，本发明利用 免疫磁珠负分选法分选出的记忆性B淋巴细胞不影响B淋巴细胞的正常生长和功能、特异 性好、纯度高、收获率高。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1为RSV抗体阳性血液的筛选结果； 图2为人外周血单个核细胞（PBMCs)数目； 图3为B淋巴细胞数目； 图4为记忆性B淋巴细胞数目。
【具体实施方式】
[0010] 1、道合胞病毒感染者血液阳性病人筛选及其血液采集：由于几乎100%的人群儿 时都感染过呼吸道合胞病毒，因此我们随机挑选志愿者，每人抽取3 mL新鲜血液，设定离心 机转速为2000转离心5 min，这时所有细胞聚集于管底。小心吸取上至清新的EP管中，并 编号并利用呼吸道合胞病毒检测试剂盒Human RSV Elisa Kit筛选体内呼吸道合胞病毒阳 性高的志愿者。
[0011] 2、血单核细胞的分离：从阳性呼吸道合胞病毒病人体内抽取20mL新鲜血液并用 肝素钠作为抗凝剂，之后加入等体积的缓冲体系Hanks液与抗凝全血样本混合后加入到等 体积的淋巴细胞分离液中，设置离心机转速为2000rpm离心20min，小心取出离心管，管内 溶液中的云雾状层即为外周血单核细胞。将云雾状溶液转移至新的15mL离心管中，利用 Hanks液洗涤2次，用含体积比为10%FBS的PBS洗涤1次，1500rpm离心20min，利用体积比 为10%FBS的PBS重悬，并进行细胞计数。
[0012] 3、分选：将筛选得到的外周血单核细胞重悬，离心机转速为300rpm离心lOmin，弃 上清；用含体积比l〇%FBS的PBS稀释悬浊液为10 7个细胞/40uL，之后将每107个细胞加入 到10uL Biotin-Antibody Cocktail中，混勻后4°C放置lOmin ;再以每107个细胞加入30uL 的含体积比为l〇%FBS的PBS及20uL Anti-Biotin MicroBeads中，混匀后于4°C冰箱四维 旋转混匀器上转动30min。按每107个细胞加入l-2mL的含体积比为10%FBS的PBS洗涤细 胞，离心机转速300rpm离心lOmin，弃上清后加入500uL含体积比为10%FBS的PBS重悬细 胞；将分选柱子放置到磁铁上，用适量的含体积比为10%FBS的PBS冲洗柱子；将细胞悬液 加到柱子中，收集流出液，用5ml体积比为10%FBS的PBS洗柱3次，洗柱过程要等柱子中液 体流干后再加含体积比为10%FBS的PBS，收集所有洗脱液，即为B细胞悬液。
[0013] 4、性B淋巴细胞的分选：将B细胞悬液在离心机中按300rpm离心lOmin后弃上 清，每1〇 7个细胞加入80uL含体积比为10%FBS的PBS重悬细胞；以每107个细胞加入20uL CD19和CD27 MicroBeads混匀，4°C冰箱中四维旋转混匀器上转动15min ;再以每107个细胞 加入l-2mL含体积比为10%FBS的PBS洗涤细胞，在离心机上300rpm离心lOmin，弃上清后 加入500uL含体积比为10%FBS的PBS重悬细胞，如果细胞较多，缓冲液加倍；将分选柱子放 置到磁铁上，用适量的含体积比为10%FBS的PBS冲洗柱子；将细胞悬液加到柱子中，收集流 出液，用适当体积的含体积比为10%FBS的PBS冲柱三次，冲柱过程要等柱子中液体流干后 再加含体积比为l〇%FBS的PBS，收集所有洗脱液，即为含未标记细胞的悬液。从分离器上取 下柱子放到一个收集管上，吸取适量含体积比为10%FBS的PBS至柱子中，立即用力推动活 塞洗出磁珠标记的细胞，即为含记忆性B细胞的悬液，细胞计数。
【权利要求】
1. 一种体外分离记忆性B细胞方法的建立，其特征是：本发明所述制备方法包括下列 步骤： (1) 呼吸道合胞病毒感染者血液阳性病人筛选及其血液采集：鉴于100%的人群儿时都 感染过呼吸道合胞病毒，随机挑选志愿者，每人抽取3 mL新鲜血液，设定离心机转速为2000 转离心5 min，此时所有细胞聚集于管底，吸取上清至新的EP管中，编号并利用呼吸道合胞 病毒检测试剂盒Human RSV Elisa Kit筛选体内呼吸道合胞病毒阳性高的志愿者； (2) 外周血单核细胞的分离：从阳性呼吸道合胞病毒病人体内抽取20mL新鲜血液并用 肝素钠作为抗凝剂，之后加入等体积的缓冲体系Hanks液与抗凝全血样本混合后加入到等 体积的淋巴细胞分离液中，设置离心机转速为2000rpm离心20min，取出离心管，管内溶液 中的云雾状层即为外周血单核细胞；将云雾状溶液转移至新的15mL离心管中，利用Hanks 液洗涤2次，用含体积比为10%FBS的PBS洗涤1次，1500rpm离心20min，利用体积比为 10%FBS的PBS重悬，并进行细胞计数； (3) 总B淋巴细胞分选：将筛选得到的外周血单核细胞重悬，离心机转速为300rpm离 心lOmin，弃上清；用含体积比10%FBS的PBS稀释悬浊液为10 7个细胞/40uL，之后将每107 个细胞加入到10uL Biotin-Antibody Cocktail中，混勻后4°C放置lOmin ;再以每107个细 胞加入30uL的含体积比为10%FBS的PBS及20uL Anti-Biotin MicroBeads中，混匀后于 4°C冰箱四维旋转混匀器上转动30min ;按每107个细胞加入l-2mL的含体积比为10%FBS的 PBS洗涤细胞，离心机转速300rpm离心10min，弃上清后加入500uL含体积比为10%FBS的 PBS重悬细胞；将分选柱子放置到磁铁上，用适量的含体积比为10%FBS的PBS冲洗柱子；将 细胞悬液加到柱子中，收集流出液，用5ml体积比为10%FBS的PBS洗柱3次，洗柱过程中要 等柱子中液体流干后再加含体积比为10%FBS的PBS，收集所有洗脱液，即为B细胞悬液； (4) 记忆性B淋巴细胞的分选：将B细胞悬液在离心机中按300rpm离心lOmin后弃上 清，每1〇7个细胞加入80uL含体积比为10%FBS的PBS重悬细胞；以每10 7个细胞加入20uL CD19和CD27 MicroBeads混匀，4°C冰箱中四维旋转混匀器上转动15min ;再以每107个细胞 加入l-2mL含体积比为10%FBS的PBS洗涤细胞，在离心机上300rpm离心lOmin，弃上清后 加入500uL含体积比为10%FBS的PBS重悬细胞，如果细胞较多，缓冲液加倍；将分选柱子放 置到磁铁上，用含体积比为10%FBS的PBS冲洗柱子；将细胞悬液加到柱子中，收集流出液， 用含体积比为l〇%FBS的PBS冲柱三次，冲柱过程中要等柱子中液体流干后再加含体积比为 10%FBS的PBS，收集所有洗脱液，即为含未标记细胞的悬液；从分离器上取下柱子放到一个 收集管上，吸取适量含体积比为10%FBS的PBS至柱子中，立即用力推动活塞洗出磁珠标记 的细胞，即为含记忆性B细胞的悬液，细胞计数。
【文档编号】C12N5/0781GK104046591SQ201410284551
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】陈廷涛, 辛洪波, 魏强 申请人:南昌大学